组间菌落数误差率?
(三组间菌落平均数?各组菌落平均数)的绝对值之和?100%3?三组间菌落平均数
（4）第6组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应更换无污染的试剂重新进行试验。 （5）连续 3 次试验取得合格评价。 2.1.1.5.8 注意事项
（1） 试验所分各组均有其特定意义，不得任意删减。
（2） 严守无菌操作，保持试液和器材的无菌，注意更换吸管，以防止沾染影响试验的准确性。
（3） 在计算微生物浓度时，须考虑其稀释倍数。 （4） 试验组序应按本规范所列排列。 2.1.1.6 物理法去除残留消毒剂的鉴定试验 2.1.1.6.1 目 的
通过本鉴定试验，确定常用的物理去除法是否可去除消毒体系中残留的消毒剂，使消毒剂鉴定试验显示出真正的杀菌效果。 2.1.1.6.2 试验器材
（1）过滤冲洗法需用经过灭菌处理的滤器、微孔滤膜、真空泵（或抽滤泵）。 （2）离心沉淀法需用离心机与离心管。
（3）吸附柱、分子筛柱（主要供病毒灭活试验用）。
（4）无菌稀释液、冲洗液。要求不应影响除药材料（如滤膜、吸附柱等）的性质，对微生物无伤害作用。常用的有：水、缓冲液（如PBS）、稀释液、含0.1%～0.5%吐温80的PBS、中和剂（可中和部分消毒成分）。
（5）其他器材随所用试验微生物而定。 2.1.1.6.3 试验设计原则
（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所选方法是否对测试消毒药物有良好的去除作用，对试验用微生物以及其恢复期培养是否有害或不良影响。
（2）试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。浓度过低不足以显示能否将高浓度药物全部去除。
（3）鉴定试验中，消毒后去除残留消毒剂组无微生物生长，不能表明去除处理后细菌是否复苏。此时可增加处理时间或次数，亦可适当缩短作用时间再试。作用时间最短不得少于30s，否则难以控制试验的准确性。
（4）同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，所用物理除药法应按微生物种类分别进行鉴定试验，不得互相取代。对细菌繁殖体的试验，可在大肠杆菌（8099）、绿脓杆菌（ATCC 15442）或金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）中任选其一进行试验即可；对细菌芽孢，以枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。
当用其他特定微生物 （如龟分枝杆菌脓肿亚种） 进行杀灭试验时，均应以该特定微生物再次进行除药方法的鉴定试验。
（5）鉴定中应根据正式杀灭试验的设计，选择使用悬液定量试验，还是载体定量试验。通常，悬液鉴定试验结果可用于载体试验。 2.1.1.6.4 物理去除方法的鉴定
（1）分组方法如下：
1）消毒剂 + 菌悬液 → 培养
观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制作用。
2）（菌悬液 + 消毒剂） + 过滤冲洗法处理 → 培养 观察所用除药处理是否可使试验菌复苏生长。 3）（菌悬液 + 水） ＋过滤冲洗法处理 → 培养 观察除药处理是否影响试验菌的生长数量。 4）菌悬液 → 培养
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将结果作为阳性对照值。 （2）操作程序如下： 1） 第 1 组。吸取消毒剂 4.5ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中 5min 后， 吸加0.5ml 菌悬液，混匀，作用至试验预定时间。吸取该最终样液0.5ml，加于含4.5ml 稀释液试管中，混匀。吸取最终样液 1.0ml 接种于平皿内，做活菌培养计数。
2） 第 2 组。吸取消毒剂 4.5ml 于试管中，置 20℃±1℃水浴中 5min 后，吸加 0.5ml 菌悬液，混匀。作用至试验预定时间，对其进行除药处理，并取最终样液 1.0ml 接种于平皿内，做活菌培养计数（如为滤膜法，可直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面）。如平皿生长菌落数均超过300 个，应再吸取该最终样液 0.5ml，用 PBS 做适当稀释，选择适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿内，做活菌培养计数。
3） 第 3 组。吸取稀释液4.5ml 于试管内，置20℃±1℃水浴 5min 后，吸加 0.5ml 菌悬液，混匀。不加消毒剂，做同上处理。取最终样液 0.5 ml 用稀释液做 10 倍系列稀释，选择 2个～3个适宜稀释度悬液，各取 1.0ml，分别接种于平皿内，做活菌培养计数（如为滤膜法，可先进行10 倍系列稀释，再经过滤冲洗法处理，然后直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面）。
4） 第 4 组。吸取试验菌悬液 0.5ml，置含 4.5ml 稀释液的试管中，不加消毒药物，亦不作任何除药处理，进行活菌培养计数，作为阳性对照值。
（3） 评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格: 1） 第 1 组无试验菌，或仅有极少数生长。
2） 第 2 组有远较第 1 组为多，但较第 3、4（组）为少的试验菌生长。在第 1 组无菌生长时，第 2 组平均每个平板 （或滤膜） 上生长菌落不少于 5 个。
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3） 第 3、4 组测定的结果，微生物数量应在 5×10 cfu/ml～5×10cfu/ml 之间， 其组间差不得超过两组回收菌数平均值的50%。组间差的计算可按下式进行:
（两组间菌落平均数?各组菌落平均数）的绝对值之和组间菌落数误差率??100%2?两组间菌落平均数
4）连续 3 次试验取得合格评价。 5）本规范推荐使用过滤冲洗法。 2.1.1.6.5 注意事项 见 2.1.1.5.8。 2.1.1.7 细菌定量杀灭试验 2.1.1.7.1 目 的
在试验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上细菌繁殖体和细菌芽孢所需剂量，以作为制定实用消毒剂量的参考。 2.1.1.7.2 试验器材
（1）按 2.1.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和枯草杆菌黑色变种芽孢悬液或菌片。此外，根据消毒药物特定用途或试验特殊需要，准备其他菌种的悬液或菌片。
（2）消毒剂溶液除有特殊规定者外，应使用无菌硬水配制。消毒剂溶液浓度应以所含有效成份为准。例如，含氯消毒剂以所含有效氯浓度为准，碘伏以所含有效碘为准，过氧乙酸以所含过氧乙酸量为准，复方消毒剂浓度以主要杀菌有效成分的量为准。各组消毒剂溶液有效成份浓度的计算，应以菌药混合液中有效成份的最终浓度为准。
（3）去除残留消毒药物的中和剂或设备 （经鉴定试验证实合格的中和剂或有关器材）。 （4）消毒剂稀释用的硬水：见附录A。
（5）有机干扰物质。悬液试验用3%BSA溶液，载体试验直接用TSB(见附录A)。 （6）营养琼脂培养基：见附录A。 （7）刻度吸管 （1.0ml、5.0ml）。 （8）恒温水浴箱。
（9）喷雾器（用于喷雾消毒试验）。
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（10）电动混合器。 （11）秒表。 2.1.1.7.3 试验分组
试验中应分以下各组：
（1）试验组。按测试目的有两种选择。 第一种适用于消毒产品鉴定。根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定一株抗力较强的菌和一个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）和 3 个作用时间（说明书指定最低作用时间，指定最低作用时间的一半，指定最低作用时间的一倍。如说明书指定最低时间为20min，则应进行10min、20min、40min 三个时间）进行试验。
第二种适用于消毒产品监督机构日常监测。根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定一株抗力较强的菌和一个消毒剂浓度和一个作用时间（说明书指定最低作用时间）进行试验。
（2）阳性对照组。根据各种试验的规定，用稀释液代替消毒剂溶液，按上述同样的步骤进行试验。所得结果代表菌液原有浓度，以其作为计算杀灭对数的初始浓度。 2.1.1.7.4 悬液定量杀菌试验操作程序
（1）首先按产品说明书要求配制消毒液。无特殊说明者，一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍（例如要评价的消毒液浓度为200mg/L，则应配制250mg/L），
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置20℃±1℃ 水浴备用。然后，按照2.1.1.2 配制实验用菌悬液，浓度为1×10cfu/ml～
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5×10cfu/ml,(实际作用时菌浓度为10cfu/ml。然后取消毒试验用无菌大试管，先加入0.5ml有机干扰物质，再加入0.5ml试验用菌悬液，混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。
（2）待菌药相互作用至各预定时间，分别吸取 0.5ml 菌药混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中，混匀。
（3）各管菌药混合液经加中和剂作用 10min 后，分别吸取 1.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，但每管样液接种 2 个平皿即可。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。
（4）同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。
（5）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
（6）试验重复3次，计算各组的活菌浓度 （cfu/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对数值:
杀灭对数值 (KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度对数值（Nx）
计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，最后一位数可以进行数字修约。 2.1.1.7.5 载体浸泡定量杀菌试验操作程序
（1）取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0ml 的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。
（2）将盛有消毒剂平皿置 20℃±1℃ 水浴箱内 5min 后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3 片，并使之浸透于消毒液中。
（3）待菌药相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0ml 中和剂试管中。用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲 80 次，使菌片上的细菌被洗脱进入中和液中，再放置5min以上，使中和作用充分。最终进一步混匀后，吸取 1.0ml 直接接种平皿，每管接种 2 个平皿，测定存活菌数。
（4）另取一平皿，注入 10.0ml 稀释液代替消毒液，放入 2 片菌片，作为阳性对照组。其随后的试验步骤和活菌培养计数与上述试验组相同。
（5）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
（6）试验重复 3 次 （包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N），并按上节公式计算杀灭对数值。 2.1.1.7.6 载体喷雾定量杀菌试验操作程序
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（1）根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定1个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）和 3 个作用时间（说明书指定最低作用时间，指定最低作用时间的一半，指定最低作用时间的一倍。如说明书指定最低时间为20min，则应进行10min、20min、40min.三个时间）进行试验。
（2）选定消毒剂的浓度与作用时间。每种菌所染菌片应分开进行试验。试验时，每种载体菌片各取 3 片，以等边三角形或三角形阵列，均匀排布于一未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内）。
（3）每批试验以同一浓度消毒剂溶液对上述排列的菌片进行均匀喷雾。每次喷雾的距离和压力保持一致，以尽量使喷到菌片上的雾粒大小和数量一致。喷雾量以不使菌片湿透、流液为度。
（4）待菌药相互作用至各规定时间，取每种载体菌片 1 片，各放入一含 5.0ml 中和剂的无菌试管中。将试管用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上细菌被洗脱进入中和液中。
（5）吸取 1.0ml 上述洗液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，但每管接种 2 个平皿。
（6）每批试验均应换一块未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板。喷雾器换装新浓度消毒剂前，应将原残留消毒剂洗净，再换装新浓度消毒剂。
（7）用蒸馏水代替消毒液，按同样的喷雾方法进行处理，作为阳性对照组。如为压力罐装自动喷雾式气雾消毒剂，可直接用染菌载体作活菌计数，作为处理前阳性对照组。
（8）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
（9）试验重复 3 次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数值（N），并计算杀灭对数值。
2.1.1.7.7 定量杀菌试验的评价规定
（1）产品监督检验，在产品说明书指定的浓度与最低作用时间，重复试验3次。要求定量杀灭悬液试验中，各次的杀灭对数值均≥5.00，可判定该产品消毒合格。但对载体定量杀灭试验，要求各次的杀灭对数值均≥3.00可判定消毒合格。
（2）产品申报卫生许可检验中，要求在产品说明书指定的浓度与3作用时间，重复试验3次。在产品指定浓度与最低作用时间，以及最低作用时间的一倍时，各次的杀灭对数均应达到消毒合格要求。在产品指定浓度与最低作用时间的一半时，可容许对不同细菌或在部分重复次数中，出现不合格结果。
（3）报告中应将各此试验的结果全部以表格的形式列出。阳性对照组应列出各次菌浓度，以及平均菌浓度。试验组应列出杀灭对数值，杀灭对数值大于5.00时，应表示为≥5.00，而不必列出具体的数字；杀灭对数值低于5.00时，应列出具体的数字（例如2.58，4.65）。 2.1.1.7.8 注意事项
（1）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。
（2）试验中所使用的中和剂、稀释液和培养基等，各批次均应进行无菌检查，发现有菌生长，则全部试验需换用未污染试剂或培养基重做。
（3）悬液定量杀菌试验时，有机干扰物质一般采用3%（g/100ml）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。如果某消毒剂说明书中指定，其产品只用于清洁物品或器械的消毒或只清洗消毒，可采用0.3%（g/100ml）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。 2.1.1.8杀灭分枝杆菌试验 2.1.1.8.1 目的
在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上分枝杆菌所需剂量，以作为制定对分枝杆菌（包括结核杆菌）实用消毒剂量的参考。 2.1.1.8.2 试验器材
(1) 试验菌株 龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC 93326
(2) 培养基 分枝杆菌干燥培养基(上海奥普生物医药有限公司) (3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备（按 2.1.1.2所示方法制备） (4) 中和剂 (根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者)
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(5) 稀释液 0.1% 胰蛋白胨的生理盐水溶液 (6) 消毒剂稀释用硬水：见附录A。 (7) 有机干扰物质：见附录A。
(8) 刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml) (9) 恒温水浴箱
(10) 喷雾装置（用于喷雾消毒试验） (11) 电力混合器。 (12) 计时装置。 (13) 培养箱
2.1.1.8.3 龟分枝杆菌脓肿亚种 ATCC 93326 菌悬液的制备
（1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0ml营养肉汤试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于分枝杆菌培养基平板上，于 37℃ 培养 72h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于分枝杆菌培养基斜面，于 37℃ 培养 72h，即为第3代培养物。
（2）取第3代～14代的分枝杆菌培养基斜面新鲜培养物（72h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使细菌悬浮均匀。
（3）将制成的菌悬液，进行活菌培养计数（见 2.1.1.3），按其结果用稀释液稀释至所需浓度。
（4）菌悬液保存在4℃ 冰箱内备用。当天使用不得过夜。 2.1.1.8.4 试验分组 试验分为下列各组:
(1) 试验组,按 2.1.1.7.3 规定，选定消毒剂浓度与作用时间。
(2) 阳性对照组, 以稀释液代替消毒剂溶液,按 2.1.1.7.3 规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含受试菌的初始浓度，并以其计算消毒因子对受试菌的杀灭对数值。
(3) 阴性对照组,观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。 2.1.1.8.5 试验程序
常用杀灭试验有: 悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀菌试验等。其操作程序详见 2.1.1.7.4,2.1.1.7.5,2.1.1.7.6。 活菌培养计数时, 在 37℃ 中培养1周， 观察最终结果。 2.1.1.8.6 评价规定
(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验 3 次 ，各次试验的杀灭对数值均 ? 5.00 ,可判定该产品对分枝杆菌污染物消毒合格。
(2)产品鉴定检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验 3 次，在产品规定使用浓度与最低作用时间，以及最低作用时间的一倍时，各次试验的杀灭对数值均应 ? 5.00,在产品规定使用浓度与最低作用时间的一半时，在3 次试验中允许有一次试验对数值 ? 5.00，可判为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量。
2.1.1.9 真菌杀灭试验 2.1.1.9.1 目的
在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上真菌繁殖体或真菌孢子所需剂量，以作为制定实用消毒剂量的参考。 2.1.1.9.2试验器材
(1) 麦芽浸膏琼脂（MEA）：见附录A。 (2) 沙堡琼脂培养基：见附录A。
(3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备 白色念珠菌ATCC 10231 和黑曲霉菌ATCC 16404 或孢子悬液与菌片按 2.1.1.9.3(1) 和 2.1.1.9.3(2) 所示方法制备。
此外，根据消毒剂特定用途和特殊需要，可选用其它真菌或孢子悬液与菌片。
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消毒技术规范
