2.1.1.3.3 操作程序
本规范要求在杀菌试验中的活菌培养计数统一使用倾注法。其操作程序如下。
（1）对菌悬液可直接进行培养计数。对菌片、采样棉拭与小型固体样本等，应将其上的细菌洗下成为菌悬液后进行培养计数。洗菌时，一般以稀释液为洗液。具体方法如下: 取含 5.0ml 稀释液无菌试管，对菌片或小型固体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。而后，用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80 次），将菌洗下形成菌悬液。以上操作应严格按无菌要求进行。
（2）将试管按需要数量分组排列于试管架上， 每管加入 4.5ml 稀释液。各组由左向
-1-2-3
右，逐管标上 10、10、10......等。
（3）将菌悬液样本在用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），随即吸取
-1
0.5ml加至 10 管内。
-1
（4）将 10 管依前法用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），混匀，再
-2
吸取出 0.5ml 加入10管内。如此类推，直至最后一管。 必要时，还可作某稀释度的1:1 或 1:4 稀释。
（5）选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为 30cfu～300cfu 者为宜），吸取其中混合均匀的悬液 1.0ml 加于无菌平皿内。每一稀释度接种 3个平皿。一般，需接种2个～3个不同稀释度。平皿加样前，应先按组编号，以免弄混。
（6）将冷至 40℃～45℃ 的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿 15ml～20ml。
（7）将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放于台上。待琼脂凝固后，翻转平皿，使底向上，置 37℃ 温箱内培养。
（8）每日观察细菌生长情况。培养至规定时间（细菌繁殖体为 48h，白色念珠菌与细菌芽孢为 72h），计数最终结果的菌落数。
（9）对菌片和采样棉拭洗液的活菌培养计数，先按各试验要求处理（如去除残留消毒剂等），而后取其最终样液按上法进行培养计数。
（10）计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在30～300的平板为准，每个稀释度 3 个平板生长菌落数全合乎上述标准，则以该 3 个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合上述标准，则以该合格的两个平板菌落的平均值为结果。
对估计菌量极少的样本（如消毒处理后样本），在培养计数时可不作稀释，即使平板菌落数未达 30 时，亦可用其计算最终结果。
将求得的平均菌落值，再乘以稀释倍数，即得每毫升原样液中的菌量。菌量单位为cfu。 2.1.1.3.4 活菌计数中技术操作误差的测定
试验者在活菌计数中因技术操作而引起的菌落数误差率（平板间、稀释度间）不宜超过10%。对误差率的自检，可按以下公式计算。
（1）平板间误差率计算公式：
平板间误差率?
平板间菌落数平均差?100%
平板间菌落平均数(平板间菌落平均数?各平板菌落数)的绝对值之和
平板数平板间菌落数平均差?
平板间菌落平均数?各平板菌落数之和
平板数
（2）稀释度间误差率计算公式：
稀释度间菌落数误差率?稀释度间菌落数平均差?100%
稀释度间菌落平均数26
稀释度间菌落平均差?
(稀释度间菌落平均数?各稀释度菌落数)的绝对值之和稀释度数稀释度间菌落平均数?各稀释度平均菌落数之和
稀释度数
2.1.1.3.5 注意事项
（1）严格无菌操作，防止污染。
（2）认真检查试验器材有无破损（ 要特别注意试管底的裂痕和破洞），以防丢失样本和污染环境。
（3）注意菌液的均匀分散。
（4）稀释或取液时要准确，尽量减少吸管使用中产生的误差。 （5）每吸取一个稀释度样液，必须更换一支吸管，以减少误差。
（6）样液接种于平皿后应尽快倾注营养琼脂培养基，避免样液干燥于平皿上，影响结果的准确性。
（7）倾注时琼脂培养基温度不得超过 45℃，以防损伤细菌或真菌。倾注和摇动时，动作应尽量平稳，以利细菌分散均匀，便于计数菌落。勿使培养基外溢，以免影响结果的准确性和造成环境的污染。
（8）为提高试验成功率，最好先用浊度计对原菌液含菌量做出估计，尽可能在首次试验时所取的有限稀释范围内（2个～3个 稀释度）即有长菌在 30cfu～300cfu 之间的平板。
（9）结果计算时，必须弄清稀释倍数，以免计算错误。 2.1.1.4 残留消毒剂的去除方法 2.1.1.4.1 目 的
在化学消毒试验中，达到规定消毒时间终点时，要求立即终止残留消毒剂的继续作用，以便准确检测出消毒体系中残留存活的微生物及其数量。因为消毒体系中残留的消毒剂，可能对微生物的生长繁殖具有一定抑制作用，从而可导致对杀菌效果偏高的错误判断，甚至产生假阴性结果。残留消毒剂的去除（下简称除药），可排除残留消毒剂对微生物的抑制，从而使试验获得正确结果。 2.1.1.4.2 除药的原则
（1）可有效去除残留的消毒剂。
（2）对微生物无害，不减少微生物应有的回收量。 （3）不破坏培养基的营养成份，不影响其透明度。
（4）必须按规定方法进行鉴定试验，并认为合格者方可在相应的消毒试验中使用。 2.1.1.4.3 除药的方法
（1） 化学中和法：又称中和剂法，是指在消毒剂与微生物作用到达规定时间的终点时，取样加于适宜种类和浓度的中和剂中，将残留消毒剂迅速中和，使其不再持续抑制或杀灭微生物的方法。本法同时含有稀释作用效果（至少1:1稀释，常用1:10稀释）。是最为普遍使用的方法。
对常用消毒剂，虽有一些中和剂介绍，但在实用中由于情况多变，效果不一定都理想。所以，在消毒试验前仍应将拟用中和剂按试验具体情况，经鉴定合格后再使用。
操作要点: ①对接触消毒剂的微生物样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂溶液中；②所用中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同；③即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；④在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物接触过久。
（2）过滤冲洗法
将经消毒剂作用过的微生物样本，立即加入适量稀释液中混匀（通过适量稀释，可减轻消毒剂的持续作用），并倾入装有微孔滤膜的滤器内，接真空泵抽吸过滤（或加压过滤）后，再加适量稀释液冲洗，同时过滤，可去除残留的消毒剂。多用于难以找到适宜中和剂的消毒
27
剂试验中，如以植物提取物制备的消毒剂。本除药方法应按拟进行试验具体情况，经鉴定合格后再使用。
操作要点: ①准备好装有相应孔径微孔滤膜的滤器；②滤膜及滤器需先经灭菌处理；③初次过滤后，应使用一定量对微生物无害的稀释液进行冲洗，冲洗次数一般以洗净消毒剂为准；④最后一次冲洗、滤净后，将微孔滤膜以无菌操作法取出，进行随后的培养检测。
（3） 稀释法
将经消毒剂作用过的微生物样本，用稀释液稀释，降低残留消毒剂浓度，以消除对微生物的抑制作用。但若稀释过多，微生物浓度下降，可出现假阴性结果。本法可单独使用，但更常见的是与其它方法同时使用。单独使用时，一般多用于浓度系数较高的消毒剂（如醇类消毒剂）。本法应按拟进行试验具体情况，经鉴定合格后再使用。
操作要点: ①对接触消毒剂的微生物样本，在达到规定作用时间后，即时以对微生物无害的稀释液稀释，稀释比例随试验需要决定；②磁力混合或敲打振荡，使之混匀；③吸取稀释样液进行随后培养检测。 2.1.1.4.4 注意事项
（1）处理时应严守无菌操作要求，所有试液须无菌，接触样本和试液的器材（如吸管、平皿、试管、滤材等）亦均须经灭菌，以免污染样本，影响试验结果。
（2）每次吸液，均须更换一支无菌吸管，以防交叉污染。此点由于操作繁琐，器材需求量大，往往不能认真执行，应加以注意。
（3）为保证试验的准确性，所用吸管的容量应尽量与拟吸取的液体量相近，不要用大吸管吸取少量液体；试验样本的混匀操作，必须认真进行；尽量减少中和剂或中和产物与试验微生物的接触时间。
（4）所用方法适宜与否，和消毒剂性质、复方中的附加成份、试验微生物种类、消毒试验种类等等均有关系，试验条件稍有改变就可能影响除药效果。故每进行一种消毒试验（包括消毒剂或微生物的更换），均需按规定对所选方法进行鉴定试验，合格者方可用于正式试验。此步骤绝不可省略，否则极有可能导致试验产生错误结果。 2.1.1.5 中和剂鉴定试验 2.1.1.5.1 目 的
确定所选中和剂是否适用于拟进行的细菌和真菌杀灭试验。 2.1.1.5.2 试验器材
（1）试验菌菌悬液和菌片（见 2.1.1.2）。 （2）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。 （3）小平皿（4 cm～6cm 直径）。 （4）恒温水浴箱。
（5）稀释液：见附录A。
（6）营养琼脂培养基：见附录A。 （7）电动混合器 2.1.1.5.3 试验设计原则
（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试消毒剂有良好的中和作用，对试验用细菌以及其恢复期培养是否有害或不良影响。
（2）在确定用何种中和剂进行鉴定试验有困难时，可对多个中和剂进行初选以确定 （见本节文后【附】）。
（3）试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。浓度过低，则不足以显示能否将高浓度消毒药物全部中和。
（4）鉴定试验中，消毒后去除残留消毒药物组（第2组）无菌生长，不能表明中和后细菌是否复苏。此时可适当缩短作用时间再试，但作用时间最短不得少于30s，否则难以控制试验的准确性。若缩短作用时间后仍无菌生长，在排除其他原因的基础上，可适当下调杀菌试验中消毒药物浓度，再次进行中和剂鉴定试验。
（5）同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，所用中和剂应按微生物种类分别进行鉴定试验，不得取代。对细菌繁殖体的试验，在大肠杆菌（8099）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、绿脓杆菌（ATCC 15442）中任选其一进行试验即可；对细菌芽孢，以枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。
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当用其他特定微生物进行杀灭试验时，均应以该特定微生物进行中和剂的鉴定试验。 （6） 鉴定时根据所用杀菌试验方法，使用相应的悬液或载体定量试验。 【附】 中和剂初选试验
中和剂鉴定试验前，若难确定拟检测的中和剂，可通过本试验初选，而后以选中的中和剂进行正式的鉴定试验。初选操作程序如下：
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（1）将 0.5ml 试验菌悬液（含菌量为 1×10 cfu/ml～5×10 cfu/ml）加入含 4.5ml 中和剂试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用营养琼脂倾注法培养。
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（2）将 0.5ml 试验菌悬液（含菌量为 1×10 cfu/ml～5×10 cfu/ml）加入含 4.5ml中和产物试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用营养琼脂倾注法培养。
（3）试验同时设阳性对照组。阳性对照组以 0.5ml 菌悬液加入含 4.5ml 稀释液试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用营养琼脂倾注法培养。
当3组平板上长出的菌落数接近，如果以阳性对照组为标准（X），前两组长菌数为（X±50%X）以内，可选做进一步鉴定试验。
[ 注意：本试验虽为初选试验，但选中的中和剂95%以上均能通过正式的鉴定试验。如果初选出多种中和剂，则应依次进行正式鉴定试验，选其中效果最好者进行杀菌试验。若均未能通过正式鉴定试验，应设计新的中和剂，重新进行初选试验。] 2.1.1.5.4 试验分组
在细菌与真菌杀灭试验中所用除药方法的鉴定，至少应平行进行以下各组试验。 （1）消毒剂 + 菌悬液 → 培养
观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。 （2）（消毒剂 + 菌悬液） + 中和剂 → 培养 观察残留消毒剂被中和后试验菌有无复苏生长。 （3）中和剂 + 菌悬液 → 培养 观察中和剂是否抑菌。
（4）（消毒剂 + 中和剂）+ 菌液 → 培养
观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对细菌或酵母菌有无抑制作用。 （5）稀释液 + 菌悬液 → 培养 作为菌悬液阳性对照。
（6）稀释液 + 中和剂 + 培养基 → 培养 作为试验材料阴性对照。
2.1.1.5.5 中和剂悬液定量鉴定试验操作程序
根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按规定程序吸取或添加试剂和试验样本。
（1）第 1 组。吸取消毒剂 4.5ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，吸加 0.5ml菌悬液，混匀。作用至预定时间，吸此样液 0.5ml 加于含有 4.5ml 稀释液试管中混匀。吸取该最终样液1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
（2）第 2 组。吸取消毒剂 4.5ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，吸加 0.5ml 菌悬液，混匀。作用至预定时间，吸此样液 0.5ml 加于含 4.5ml 中和剂溶液管中，混匀，作用 10min。吸取该最终样液 1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
如平板生长菌落数均超过 300 个，应以稀释液对上述最终样液作适宜稀释后，再次进行活菌培养计数。
（3）第 3 组。吸取中和剂4.5ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中5min 后。再吸加 0.5ml 菌悬液，混匀。作用 10min。吸取该最终样液 0.5ml，用中和剂做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（4）第 4 组。 吸取中和产物溶液 （以 1 份消毒剂加 9 份中和剂，作用 10min 配制而成）4.5ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中5min 后，再吸加 0.5ml 菌悬液，混匀。作用10min，吸取该最终样液 0.5ml，用中和产物溶液做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（5）第 5 组。吸取稀释液 4.5ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中5min，再吸加 0.5ml 菌悬液，混匀。 作用 10min ，吸取该最终样液 0.5ml 用 稀释液 做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
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（6）第 6 组。分别吸取稀释液与中和剂各1.0ml于同一无菌小平皿内，倒入上述试验同批次的培养基15ml～20ml，培养观察。如出现细菌生长，可能提示试验材料或操作过程中有污染。应重新进行试验。
2.1.1.5.6 中和剂载体定量鉴定试验操作程序
根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本。
（1）第 1 组。吸取消毒剂 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于消毒液中。待作用至试验预定的时间，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0ml 稀释液试管中，作用 10min。用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，吸取该最终样液 1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
（2）第 2 组。吸取消毒剂 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于消毒液中，待作用至试验预定时间，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0ml 中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次。作用 10min，吸取该最终样液1.0ml，分别接种于各平皿中，做活菌培养计数。
如平板生长菌落数均超过 300个， 应重新吸取该最终样液 0.5ml，用稀释液做适当稀释，选适宜稀释度悬液，吸取1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（3）第 3 组。 吸取中和剂 5.0ml 于无菌小平皿中，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于中和剂内，作用 10min。 立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0 ml 中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，混匀。吸取该最终样液 1.0ml，用中和剂做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（4）第 4 组。 吸取中和产物溶液 （以浸有消毒剂的载体置 5.0ml 中和剂内，作用 10min） 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于中和产物溶液中。作用 10min，用无菌镊子取出菌片，移入含 5.0ml 中和产物溶液的试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，混匀。吸取该最终样液0.5ml，用中和产物溶液做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（5）第 5 组。吸取稀释液 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后， 用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于稀释液中。作用10min，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0ml 稀释液的试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，混匀。吸取该最终样液0.5ml，用稀释液 做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（6）第 6 组。分别吸取稀释液与中和剂各1.0ml于同一无菌小平皿内，倒入上述试验同批次的培养基15ml～20ml，培养观察。如出现细菌生长，可能提示试验材料或操作过程中有污染。应重新进行试验。 2.1.1.5.7 评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格: （1） 第 1 组无试验菌，或仅有极少数试验菌菌落生长。
（2） 第 2 组有较第 1 组为多，但较第 3、4、5（组）为少的试验菌菌落生长，并符合表 2-1 要求者。
表 2-1 中和剂鉴定试验合格标准中对第 1 组与第 2 组菌落数的要求 第 1 组平板平均菌落数 第 2 组平板平均菌落数
0 >5 X（1～10） >（X + 5） Y（>10） >（Y + 0.5 Y）
注：对抑菌作用不明显消毒剂（如乙醇）所用中和剂的鉴定试验中，当第 1 组与第 2 组菌落数相近，难以达到本表要求时，可根据具体情况另行作出判断和评价。
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（3） 第 3、4、5（组）有相似量试验菌生长，并在 5×10 cfu/ml（片）～5×10 cfu/ml（片） 之间。其组间菌落数误差率应不超过 15%。第3、4、5 组间菌落数误差率计算公式其计算公式如下。
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消毒技术规范
