配成含50%与25%小牛血清的微生物悬液。此含小牛血清的微生物悬液，可用于悬液定量杀菌试验，亦可滴染菌片进行载体定量试验。
（3）试验中根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序根据微生物种类可参见2.1.1.7。
（4）其它有机物按此设计类推。各组试验应重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。
2.1.1.12.6 温度对杀灭微生物效果影响的测定
（1）设置10℃±1℃、20℃±1℃、30℃±1℃等，以10℃为间隔。各组所用消毒液浓度和作用时间，见 2.1.1.12.4。
（2）对要求试验温度高于室温者，用恒温水浴箱（电热）调节；低于室温者用冷水浴装置（加适量冰水）调节。当上述温度调节装置到达要求温度后，放入装有试验样液的试管，同时放入一含与试验样液等量蒸馏水并插有温度计的试管。待试管内温度计指示到达试验所需温度时，开始随后的试验。
（3）根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。 具体试验程序根据微生物种类可分别参见 2.1.1.7。
（4）试验重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。 2.1.1.12.7 pH 对杀灭微生物效果影响的测定
（1）本项试验根据所测消毒剂使用溶液的 pH 值，分为以下 3 组进行： 第 1 组 pH 值 x - 2 第 2 组 pH 值 x 第 3 组 pH 值 x + 2
[例如，所测消毒剂使用溶液的 pH 值为 7.8，则 3 组的 pH 值应为：第 1 组 5.8，第 2 组 7.8，第 3 组 9.8。]
各 pH 组所用消毒液浓度和作用时间，见 2.1.1.12.4。
（2）对消毒液 pH 的调节，先用 pH 计测定原消毒剂的pH，在偏酸时慢慢滴加氢氧化钠溶液，偏碱时慢慢滴加盐酸溶液以调整。随时用pH 计测定消毒液的pH。当达到所要求的pH 后，停止调整，进行随后的试验。必要时，在pH 调整后可测定有效成分含量以观察是否受到pH 变化的影响。
（3）根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序见 2.1.1.7。
（4）试验重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。 2.1.1.12.8 评价规定
评价时，有机物影响试验应以不含外加有机物组（直接用稀释液配制微生物）的结果为对照；温度影响试验应以20℃±1℃ 组的结果为对照；pH 影响试验应以消毒剂使用溶液pH组的结果为对照。
（1）该组第 1个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果均合格，判为该组所试因素无影响。
（2）该组第 2个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有轻度影响。
（3）该组第 3个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有中度影响。
（4）该组只第 4 个作用时间的试验， 对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有重度影响。
（5）全部试验对所试微生物杀灭效果均不合格，判为本试验所试因素有严重影响。为取得消毒或灭菌的有效剂量，需增加消毒液浓度或作用时间，重新进行试验。 2.1.1.12.9 注意事项
（1）本试验目的是为制定消毒剂实用剂量提供必要的参考数据，系统研究各种因素对消毒剂杀灭微生物效果的影响，尚需作更多系统的观察。
（2）为加强各组结果的可比性和可重复性，非观察因素应保持稳定不变。例如，在观察有机物的影响时，除有机物浓度根据需要改变外，其他如温度和pH等因素均应先后一致。 2.1.2 消毒剂对物体表面模拟现场和现场消毒鉴定试验
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2.1.2.1 消毒剂对食(饮)具消毒效果的模拟现场鉴定试验 2.1.2.1.1 目的
用于鉴定消毒剂对食(饮)具上细菌和病毒的杀灭作用, 并测出所需使用的剂量, 作为确定该消毒剂对食(饮)具消毒实用剂量的参考。 2.1.2.1.2 试验器材
(1)大肠杆菌(8099)。对尚需用于杀灭其他特定细菌者,可增用该特定细菌进行试验。菌悬液制备按2.1.1.2规定的方法和要求进行。
(2))磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2) (3)采样液(在PBS中加入相应的中和剂) (4)稀释液：见附录A。
(5)中和剂(按2.1.1.5方法鉴定合格者) (6)胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (7)无菌棉拭
(8)规格板(用可略弯曲的软性材料制备,中央留一大小为5.0cm×5.0cm空格作为采样部位)。
(9)试验用食(饮)具样本 瓷碗（盘）和竹或木筷前端12.5cm(周长约2.0cm, 长度为
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12.5cm，总面积约25cm)各35个。 2.1.2.1.3 操作程序
(1)按产品使用说明书的用法,选定本试验拟用浓度和作用时间,分别进行大肠杆菌杀灭试验。
(2)用无菌规格板在试验用瓷碗（盘）中间标出染菌区(5.0cm×5.0cm)。用无菌吸管吸取菌悬液,分别滴加于染菌区,每区0.1ml,用无菌L棒在区内涂匀,并置37℃恒温箱干燥。
对筷子取前端12.5cm长度， 蘸染预定量菌液后,并置37℃或室温干燥。 (3)将30个染菌碗和3 0个筷子样本，缓缓放入含消毒剂溶液的容器中,使其完全浸没。待作用至规定时间后，将碗轻轻取出, 弃掉消毒剂，分别向磁盘内的染菌区加入5ml采样液，用L棒刮洗染菌区，作用10min，分别取1.0ml样液倾注接种2块平皿。将筷子轻轻取出,放入含15ml采样液的试管中,电动混匀器震荡20s或振敲8 0次，作用10min, 分别取1.0ml样液倾注接种2块平皿。将接种好的平皿放37℃恒温箱培养48h,计数菌落数，作为试验组。 (4)试验中,应设阳性对照组与阴性对照组。阳性对照组的食具与试验组同法染菌,置同样条件下,将5个染菌碗和5只筷子样本浸泡于含有PBS的容器中。待试验组消毒处理完毕后,与试验组同时进行采样和检测。所得细菌定量检测结果作为消毒前菌量。阳性对照组所
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测得的菌量应在1.25×10 cfu/样本～1.25×10cfu/样本(相当于5×10cfu/cm～
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5×10cfu/cm)。
（5）待试验组与阳性对照组试验结束后,将未用过的同批次中和剂、PBS接种培养基,和未种菌的培养基等,与上述两组样本同时进行培养,作为阴性对照。若有菌生长,更换培养基、PBS或中和剂,重新进行试验。
(6)按下式计算每件食具上的生长菌落数。
每件食具样本生长菌落数（cfu/样本）=平板上平均菌落数×检测时样本稀释倍数
（7）计算杀灭对数值。 2.1.2.1.4 评价规定
以每种食（饮）具30个样本中大肠杆菌杀灭对数值均≥3.00，所用消毒剂的浓度和作用时间为消毒合格剂量。 2.1.2.1.5 注意事项
(1)试验操作过程必须采取严格的无菌技术。直接或间接接触样本的器材必须经灭菌后 使用。模拟现场试验所用食(饮)具在染菌前亦必须经灭菌处理。 (2)每次试验必须设置阳性和阴性对照，绝不可省略。
(3)消毒前后的重复采样(试验组与阳性对照组),不得在食(饮)具同一采样区内进行。 (4)棉拭涂抹采样较难标准化,为此应注意使棉拭的大小,用力的均匀,吸取采样液的量, 洗菌时敲打的轻重等应先后一致。
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2.1.2.2 消毒剂对医疗器械的消毒模拟现场鉴定试 2.1.2.2.1 目的
用于鉴定消毒剂对医疗器械上细菌芽孢的杀灭作用作用，并测出消毒所需使用剂量，作为确定对医疗器械处理时实用剂量的参考。 2.1.2.2.2 试验器材
(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(下简称芽孢,其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)
(2)磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)
(3)中和剂溶液(经按2.1.1.2.5规定方法鉴定合格者) (4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基 （5）模拟现场试验用样本(将医用止血钳截断,取其由轴至齿端部分,参照2.1.1.2.4(2)规定方法进行脱脂处理。经压力蒸汽灭菌后,烤干备用)。 (6)塑料试管(1.8cm×18cm)。 2.1.2.2.3 操作程序
(1)以载体浸泡定量杀菌试验进行消毒效果的测定。按产品使用说明书的剂量,选定本试验拟用浓度和和作用时间。
(2)染菌时,用无菌镊子将35个止血钳样本两齿分开，使其一侧齿面朝上,并固定在无菌支撑物上。用0.1ml无菌吸管或100μl无菌移液器,将0.02ml芽孢悬液滴染于样本朝上的齿部,用无菌L型铂金丝涂匀,置37℃恒温箱内干燥备用。
(3)取无菌平皿,按每个载体10ml用量加入消毒液，置20℃±2℃水浴中保温5min。 (4)将30个染菌样本浸没于消毒液中进行消毒处理。
(5)作用至规定时间，取出样本,分别移入含10ml中和剂溶液的塑料试管内。在手掌上振敲80次，分别取样液1.0ml倾注接种两个无菌平皿,放37℃恒温箱培养72h,计数菌落数，作为试验组。
(6)以无菌蒸馏水代替消毒液，将5个染菌样同样条件处理，然后与试验组样本同法进
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行活菌培养计数，作为阳性对照组，其菌量应在5×10 cfu/样本～5×10cfu/样本。 (7)试验结束后,将用过的同批次中和剂、采样液、稀释液接种培养基,进行培养;另将未用过的同批培养基亦放入恒温箱内培养,作为阴性对照。 2.1.2.2.4 评价规定
在规定作用时间内，阳性对照组均有菌生长，活菌培养计数达到规定的数量，阴性对照均无菌生长时，以对试验组30个样本上人工污染芽孢的杀灭率对数均值≥3.00，可判为消毒合格。
2.1.2.2.5 注意事项
于本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。 2.1.2.3消毒剂对医疗器械的模拟现场灭菌试验 2.1.2.3.1目的
用于验证消毒剂对人工染有芽孢的医疗器械灭菌效果。 2.1.2.3.2 试验器材
(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(下简称芽孢,其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)
(2)磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)
(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者) (4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基 （5）模拟现场试验用样本(将医用止血钳截断,取其由轴至齿端部分,参照2.1.1.2.4(2)规定方法进行脱脂处理。经压力蒸汽灭菌后,烤干备用)。 (6)塑料试管(1.8cm×18cm)。 2.1.2.3.3 操作程序
(1)按产品使用说明书的剂量,选定本试验拟用浓度和作用时间。25个染菌样本制备和灭菌处理等,按2.1.1.2.3中 (1)～(3)规定进行。
(2) 取无菌平皿，按每个载体10ml用量加入消毒液，置20℃±2℃水浴中保温5min。 (3)将20个染菌样本浸没于消毒液中进行灭菌处理，作用至规定时间，将样本取出，分
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别放于含10ml中和剂肉汤的试管内（共20支），置37℃培养箱中定性培养7d，观察最终结果，作为试验组。有菌生长者，肉汤培养基呈轻度浑浊，有皱褶状菌菌墨，轻轻振摇可见絮状沉淀，无菌生长者肉汤清澈透明。
（4）以无菌蒸馏水代替消毒液，将两个染菌载体依上同样条件处理，然后与试验组载体同法接种、培养、观察结果，作为阳性对照组。
(5)另取3个染菌样本，分别放入10ml中和剂溶液塑料试管内。振荡20s，或在手掌上振敲80下，取样液进行活菌培养计数。培养72h计数菌落。作为菌数对照组，其活菌培养
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计数结果, 菌量应为5×10cfu/样本～5×10cfu/样本。
(6)试验结束后,将用过的同批次中和剂、采样液、稀释液接种培养基,进行培养;另将未用过的同批培养基亦放入恒温箱内培养,作为阴性对照。
(7)试验重复3次。 2.1.2.3.4 评价规定
各次试验组所有60个样本均无菌生长,同时阳性对照组均有菌生长，菌数对照组活菌培养计数达到规定的数量,而阴性对照组均无菌生长时,可批为灭菌合格。 2.1.2.3.5 注意事项
(1)灭菌效果观察时，应严格无菌操作，否则可将灭菌合格误判为失败。 (2)于本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。 2.1.2.4 连续使用稳定性试验 2.1.2.4.1目的
用于测定消毒剂在反复取放浸泡医疗器械条件下的使用有效期。 2.1.2.4.2 试验器材
(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(下简称芽孢,其悬液的制备按2.1.1.2.3.(2)规定进行)
(2)磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)
(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者) (4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基：见附录A。 （5）不锈钢载体(直径1.2cm圆片)
(6)满载用医疗器械(选用医用剪刀、止血钳等小型器械，或根据需要选用其他器械。 (7)无菌带盖搪瓷盘。 2.1.2.4.3 操作程序
(1)以枯草杆菌黑色变种芽孢为试验菌。
(2)产品说明书中规定的浓度作为本试验所用浓度,设3个作用时间,进行载体浸泡定量杀菌试验(见2.1.1.7.5)。
(3)试验时,配制双份2000ml消毒液，分别盛装于2个无菌带盖搪瓷盘中。各放入清洁的试验用医疗器械，使达满载要求。每次试验,同时对2个搪瓷盘中的消毒液进行检测。
(4)搪瓷盘内放入器械后,每日将器械取出,用清水洗涤,沥干,再回放入消毒液中。连续 每日将器械取出、洗涤、沥干、再放入，直至试验结束。
(5)放入器械当日,吸取消毒液样本，以载体浸泡定量杀菌试验法(见2.1.1.7.5)测定该消毒液 对芽孢的杀灭效果。而后,根据消毒剂稳定性规定每隔一定日期吸取一次样本进行同样的杀芽孢试验,直至观察到失效时(或规定的日期)为止。全过程中吸取样液检测次数不得少于3次。 2.1.2.4.4 评价规定
试验重复3次，以3次试验中连续使用有效期最短的日期为其有效期。 在规定作用时间内, 阳性对照组均有菌生长，活菌培养计数达到规定的数量, 阴性对照组均无菌生长时, 对芽孢的杀灭对数值均≥3.00，可判为消毒合格。各次试验所有样本均无菌生长,可判为灭菌合格。 2.1.2.4.5 注意事项
(1) 盛装消毒液的搪瓷盘，在操作完毕后应加盖，以免有杂菌污染。 (2) 灭菌效果观察时，应严格无菌操作，否则可将灭菌合格误判为失败。 (3)本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。 2.1.2.5 消毒剂对手消毒模拟现场试验
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2.1.2.5.1 目的
用于测定消毒剂对人工污染于手表面细菌的杀灭作用, 并作为确定该消毒剂对手消毒实用剂量的参考。 2.1.2.5.2 试验器材
（1）大肠杆菌8099或NCTC 10536,对尚需用于杀灭其他特定细菌目的者,可增用该特定细菌进行试验。菌悬液制备按2.1.1.2规定的方法和要求进行。
（2）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。 （3）胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）：见附录A。 （4）中和剂(经鉴定合格) （5）液体肥皂 200g/L
（6）参考样品 正丙醇 60%（V/V）异丙醇 60%（V/V） （7）标准硬水：见附录A。
（8）磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)。 （9）无菌纱布巾
（10）吸管、试管、平皿若干 （11）振荡混合器 2.1.2.5.3 试验步骤
(1)菌悬液的制备 取2支在TSB中培养18h～24h的大肠杆菌培养物分别接种于1LTSB
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大三角烧瓶中，在36℃±1℃培养箱中培养18h～24h,用TSB将其稀释为2×10cfu/ml～
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2×10cfu/ml菌悬液。
（2）将12名～15名志愿者随机分为两组，第一组使用参考样品，第二组使用试验样品
（3）使用液体肥皂洗手1min 去除手表面污染的自然菌，然后用无菌纱布将手擦干。
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（4）将2×10cfu/ml-2×10cfu/ml大肠杆菌的菌悬液放入一无菌容器中，
（5）将手掌中间到指尖部位浸入菌悬液中，手指分开，停留５s，将手离开菌悬液，在空气中干燥３min。
（6）干燥后立即将拇指与其它手指尖在含 10ml TSB的平皿中搓洗１min，取适当稀释
度接种平皿。计数菌落数，作为试验前菌数。 （7）不再重复污染手，立即进行消毒处理。
（8）按说明书介绍的用量、作用时间和使用频率以标准的洗手方法（如图2-1）搓擦30s～60s（卫生手消毒）或最长5min（外科手消毒）。
（9）以流动的自来水冲洗5s，抖掉手上残留的水。
(10) 立刻将拇指与其它手指尖在含 10ml含中和剂的TSB的平皿中搓洗1min，做适当稀释后，分别取样液1.0ml以倾注法接种两个无菌平皿,放37℃恒温箱培养48h,计数菌落数，作为试验组。
(11) 参考样品组,对于卫生手消毒，取3 ml异丙醇（propan-2-ol） 60%（ml/100ml）到入手心中，按标准的洗手方法用力搓擦30s。以确保手的所有部位均匀接触异丙醇。重复使用异丙醇按上述方法搓擦使总的搓擦时间为60s。对于外科手消毒,使用3ml正丙醇 （propan-1-ol） 60%(ml/100ml) 按标准的洗手方法用力搓擦 ，当接近干燥时，再加3ml正丙醇搓擦。以保持作用3min。
1.掌心对掌心搓擦 2.手指交错掌心对手背搓擦 3.手指交错掌心对掌心搓擦
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消毒技术规范..-消毒现场试验
