现代生物技术与生物技术药物 

神经生长因子（NGF）及各种神经营养因子。

5．重组蛋白质与多肽类激素：通过DNA重组技术，使蛋白质与多肽类激素既可大规模制备，又可解决人源化问题。已研制成功的重组蛋自质与多肽类激素主要有：人重组胰岛素（Humulin）、人生长激素（rhGH）、促卵泡激素（FSH）、促黄体生成素（LH）和绒毛膜促性腺激素（HCG）等。

6．心血管病治疗剂与酶制剂：心血管病治疗剂与酶制剂主要用于心血管疾病和抗肿瘤治疗。主要品种有Ⅷ因子、水蛭素、tPA、尿激酶、链激酶、葡激酶、门冬酰胺酶、超氧化物歧化酶、葡萄糖脑苷酶及DNase等。

7．重组疫苗与单抗制品：重组疫苗有重组乙肝表面抗原疫苗（酵母）、乙肝基因疫苗（重组乙肝表面抗原疫苗、CHO细胞）、艾滋病疫苗和肿瘤疫苗等。已开发的单克隆抗体有72种，多用于治疗难治性疾病如预防移植物急性排斥、免疫性疾病和肿瘤等。

8．基因药物：基因药物是指应用于基因治疗目的的DNA片段重组药物。基因治疗是指将外源基因导人机体以达到治疗疾病的目的。除用于遗传性疾病治疗外已扩展到用于治疗肿瘤、艾滋病、囊性纤维变性、糖尿病和心血管病等。 三、生物技术药物发展史

1973年美国斯但福大学医学院的S.N.Cohan等第一次将两种不同DNA分子进行体外重组，并在大肠埃希菌中获得表达。从此揭开了基因工程技术的序幕。他们构建了抗四环素与抗链霉素基因的重组质粒，并在大肠杆菌中进行复制，表现出双亲质粒的遗传信息。1974年他们又将带有抗青霉素和抗红霉素基因的金黄色葡萄球菌质粒和大肠杆菌质粒重组在一起，将此种重组质粒引入大肠杆菌后，发现重组质粒在大肠杆菌中也能表达金黄色葡萄球菌的抗青霉素特性。同年Cohan和Boyer合作将非洲蟾蜍的核糖体RNA机构基因插入到大肠杆菌质粒DNA中，再转化人大肠杆菌，结果发现在大肠杆菌中非洲蟾蜍核糖体RNA结构基因获得表达，这说明核糖体RNA的结构基因已在大肠杆菌中永久留下来，也就是说它具有遗传性。这一著名实验被视为基因工程研究的里程碑，从而诞生了定向改造生物遗传特性的新科学领域——基因工程学。

1977年，Hirose和Itakura用基因工程法表达了人脑激素——生长抑素，这是人类第一次用基因工程法生产具有药用价值的产品，标志着基因工程药物开始走向实用化阶段，1978年重组人胰岛素获得成功，1982年欧洲首次批准应用DNA重组技术生产动物疫苗（抗球虫病疫苗），同年美国和英国批准使用DNA重组人胰岛素，美国Elililly公司取得生产基因工程胰岛素的证书（商品名为humulin），同时Novo~Nordisk与Bio-genSA（瑞士）也签订了开发生产基因工程胰岛素的合同，1979年人生长激素又宣告用基因工程法研制成功。1980年初人干扰素基因也在大肠杆菌中表达成功。1986年人干扰素-α在美国投入市场，其后重组干扰素-γ也在欧洲获准上市。

1987年，乙肝疫苗在美国上市，组织纤溶酶原激活剂（tPA）也在同年上市，1989年，干扰素-β在日本投放市场。随后，在美、日和欧洲都积极加快研究开发各种基因工程药物，如干扰素-α、人生长激素、EPO、IL2、G-CSF、GM-CSF、M-CSF等。从1995—1999年美国FDA已批准了近30种生物技术药物。这些药物广泛应用于临床，使众多患者受益。目前，美国已上市生物技术药物116个，并有723种正在通过FDA审批，还有700多种处于不同研究阶段。

目前，世界上已有生物技术制药公司2000多家，多数诞生于美国，其余在欧洲、日本，还有少数分布在其他国家。我国从事生物技术的公司大约有200多家，基因工程药物和疫苗销售额1996年为2.2亿元，1998年增至7.2亿元，2000年达到22.8亿元，平均每年增长79.42％。其中干扰素所占比例最高，其次为乙肝疫苗、白细胞介素-2。

我国已批准上市的生物技术药物有IFN-α1b，IFNa2a，IFN-α2b，IFN-γ，IL-2，IL-2-125Ser，G-CSF，

GM-CSF，SK，EPO，EGF，EGF衍生物，b-EGF，胰岛素，GH，TPO，TNF衍生物，抗IL-8单抗乳膏剂，胸苷激酶基因工程细胞制剂，乙肝疫苗，痢疾疫苗等。其中，IFN-α1b和痢疾疫苗是我国自行研制的品种，其余均为仿制品种。

四、生物技术药物的研究发展趋势

在过去10年，生物技术新药上市率一直居于新药研究的榜首，20世纪90年代共批准370个新药，其中49个是生物技术药物（占13％）。据EMEA统计，1995年有127个新化学实体药物批准用于临床，其中生物技术药物为44种（占34％）。进行临床试验的生物技术药物，在1988年为81种，1993年143种，1996年284种，到2000年已达369种。由此可见，生物技术药物在未来医药工业经济中占有重要地位。 1．生物技术药物的发展已进入蛋自质工程药物的新时期

第一代重组生物技术药物逐步被第二代所取代，蛋白质工程技术日新月异，点突变技术、融合蛋白技术、定向进化、基因插入及基因打靶等技术使蛋白质工程药物新品种迅速增加。

通过蛋白质工程手段可以提高重组蛋自的活性，改善制品的稳定性，提高生物利用度，延长在体内的半衰期，降低制品的免疫原性等。如天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓了胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了降血糖作用，也增加了抗原性。这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致，改变这些残基，则可降低聚合作用，使胰岛素快速起作用。蛋白质工程技术在单抗人源化和制造融合蛋白方面也发挥了重大作用。当然蛋白质工程产品也有潜在缺点，如可能因结构与天然蛋白不同而增加免疫原性或降低了生物活性与治疗价值或改变了药效学和药代动力学性质，因此临床研究时，应特别仔细观察。 2．新的高效表达系统的研究与应用

从基因工程药物表达的研究策略看，迄今为止，已上市的生物技术药物（DNA重组产品）多数是在E.coli表达系统生产的（34种）；其次是CHO细胞（14种）、幼仓鼠细胞（2种）以及酿酒酵母菌（11种），正在进一步改进的重组表达系统有真菌、昆虫细胞和转基因植物和动物。转基因动物作为新的表达体系之所以更令人关注是因为能更便宜地生产复杂产品。Genzyme，Transgenics（Framingham~MA），PPL~therapuiics（Edindurgh~UK）和Pharming（Leiden，the~Netherlands）等产品已进入临床试验（主要有α1-抗胰蛋白酶，α-葡萄糖苷酶和抗凝血酶Ⅲ），还有20种产品正在用转基因山羊、绵羊或牛进行早期开发。实现用转基因动物进行生物技术药物生产，用于医疗已指日可待，通过克隆动物用于生物技术药物生产也具有发展前景，如用克隆羊使其带有人Ⅸ因子基因，用于制备Ⅸ因子。 3．将基因组和蛋自质研究成果转化为生物枝求新药的研究与开发

蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质的表达方式和功能方式的学科。蛋白质组学研究的兴起，标志着生命科学研究水平进入高质量和整体性研究阶段，因为蛋白质具有自身的特殊规律，如后修饰加工，转运定位，结构形成，蛋白质与蛋白质之间、蛋白质与核酸的相互作用等。这些均不可能从细胞水平或基因水平上研究获知。通过蛋白质组学研究，可以探索蛋白质在质量、功能、相互作用及关联网络系统的整体性、时控性和调控性，从而揭示机体的生理与病理过程，因此蛋白质组学的研究将为新药的研发提供强大的物质基础。

蛋白质组学的研究内容包括：①发现疾病特异相关蛋白，如肿瘤相关标志蛋白，可用作肿瘤诊断和治疗药物的作用靶标。②研究不同个体、不同生理病理状态下药物代谢酶谱的变化，为药代动力学和临床提供专一依据，从而发展个性化用药途径。③研究药物不良反应。毒副作用方面的蛋白质组学，为合理用药提供依据，从而建立个体的蛋白质组数据库，用于患者的蛋白质谱分类和执行个性化用药。④应用蛋白质组学技术，从传统中药中寻找天然活性物质，为实现中药现代化提供生物技术手段，如对昆虫毒素的系统活性分析，可以找到提供DNA重组生产的目的蛋白及其功能基因。

4．研究与开发生物技术药物的新剂型

生物技术药物多数易受胃酸及消化酶的降解破坏，其生物半衰期也普遍较短，需频繁注射给药，造成患者心理与身体的痛苦。即使皮下或肌内注射，其生物利用度也较低。另外多数多肽与蛋白质类药物不易被亲脂性膜所摄取，很难通过生物屏障。因此生物技术药物的新剂型发展十分迅速，如对药物进行化学修饰，制成前体药物，应用吸收促进剂，添加酶抑制剂，增加药物透皮吸收及设计各种给药系统等。 （1）埋植剂 微型渗透泵埋植剂，其外形像胶囊的埋植剂，植入后，体液可透进外壳，溶解夹层电解质层，使夹层的体积膨胀，压迫塑性内腔，使药物从开口处定速释出，已有肝素、胰岛素和NGF等埋植剂在动物体内外的研究报道。

可注射的埋植剂，以生物降解聚合物作为埋植剂或注射型缓释剂的骨架，常用的有两类：①天然聚合物，如明胶、葡聚糖、清蛋白、甲壳素等。②合成聚合物如聚乳酸、聚丙交酯、聚乳酸-羟乙酸（PLGA）、聚丙交酯乙交酯（PLCG）、聚己内酯、聚羟丁酸等。其中PLGA在体内降解为乳酸、羟乙酸进一步分解为CO2和H2O具有良好生物相容性，无免疫原性，安全性高，并可通过聚合单体比例和聚合条件调节聚合物在体内的降解速度，其应用越来越广泛。Zenica公司研制成功Zoladex注射型埋植剂，将多肽药物戈舍瑞林（goserelin）与PLGA熔融混合，经一多孔装置挤出直径为1mm的条状物切成小段，单剂量3.6mg，灭菌后，密封于一次性注射器内待用。可供皮下或肌肉内注射用。

（2）微球注射剂 有多种注射型微球的制备方法，如相分离法、复乳-液中干燥法、喷雾干燥法、低温喷雾提取法、熔融挤出法等。

另外，可以研究开发方便合理的给药途径如呼吸道吸入、直肠给药、鼻腔、口服和透皮给药等。

五、国内临床使用的主要生物技术药物简介

（一）乙型肝炎疫苗

乙型肝炎病毒（HBV）感染已是人类健康的严重威胁。据调查，我国国民中乙肝病毒携带者平均达到8.83％，全国约有一亿以上人口为无症状乙肝病毒携带者；有乙肝病人约2700万，每年发病人数在百万以上。除因乙肝病毒感染导致慢性活动性肝炎和肝硬化等而引起死亡外，在肝癌患者中，约有80％是由乙肝病毒感染引起的。因此预防乙肝感染对我国来说，是关系子孙后代健康和振兴中华大业的紧迫任务。根据现有的病毒携带率，预计从20世纪90年代初起，在疫苗目前已能保证充分供应的条件下，积极推行计划免疫，进行母婴阻断接种，那么也要到21世纪中叶才有可能使我国的乙肝病毒携带率降至现在的一半以下。由此可见，在我国，控制乙肝传播须经过几代人的努力，是一项非常严峻而艰巨的任务。

20世纪70年代初开始使用乙肝表面抗原（HBsAg）阳性血清制备乙肝疫苗预防乙肝病毒感染，开创了病毒尚不能在实验室繁殖的情况下制备疫苗的先例。但这种血源疫苗存在一些问题，如血源有限、成本较高、带有一定的潜在性危险等。特别是近年来艾滋病流行，血液制品易受HIV污染，致使乙肝血源疫苗的使用在一些国家受到限制。然而乙肝血源疫苗的生产和使用，说明HBsAg的主蛋白可以诱生良好的保护性抗体，使人免受HBV的侵袭，这一事实为研制乙肝第二代疫苗奠定了良好基础。基因工程技术的飞速发展，使基因工程乙肝疫苗的研制成为可能。 (A)重组乙肝疫苗

20世纪80年代以来，国内外学者应用基因工程试图制成乙肝疫苗，做了大量工作。比较成功的有以下几条研制路线：①使用哺乳动物细胞表达HBsAg，大体上分为两类：一是用SV40早期启动子调控乙肝病毒表面抗原基因，以dhfr为扩增基因构建的质粒转染CHO-dh-fr-细胞，选出高产HBsAg的细胞系用于制备乙

肝疫苗；二是用m-MT或h-MT为启动子调控乙肝病毒表面抗原基因，以BPV为扩增基因构建的质粒转化为小鼠乳瘤细胞C-127，选出高产HBsAg的细胞系，用其分泌的HBsAg纯化后制备疫苗。

这两种方式分别在法国和美国研制成功。第一种方式在我国也研制成功，投人生产；②使用病毒载体组建重组病毒以表达HBsAg，用作活疫苗或灭活疫苗，如用痘苗病毒载体。我国组建了不经传代细腻的重组病毒株VTH-2，它是以天然株为起始株的带乙肝表面抗原主蛋白基因的毒株（adr亚型HBsAg基因）。现已投入试生产；③使用重组酵母生产乙肝疫苗，即用DNA重组技术构建的重组酵母菌表达HBsAg，然后经过分离纯化制成疫苗，我国已引进美国Merck公司的技术投入试生产。 ［1］重组乙肝表面抗原疫苗（酵母） 简称“重组酵母乙肝疫苗” 1．结构与性质

HBsAg的基本结构是P24多肽链，它由226个氨基酸组成。以澳化氰裂解可产生5个肽段。其中80个氨基酸序列和位点已确认，与DNA序列编码的氨基酸相符合。本品电泳结果只在分子量20000～25000之间有一条主带，这条主带有HBsAg特异性，且未糖基化，不存在HBsAg中P27糖基化带。电镜检查结果表明与血源疫苗一样，均为22nm的球形颗粒。 2.临床应用

本品系由重组酵母合成的乙肝表面抗原经纯化、灭活及吸附后制成，用于预防所有亚型的乙肝病毒感染，它与血源性乙肝疫苗具有同样的效力和保护效果，但不含任何人血清成分，故更安全，更易为人们所接受。接种对象是乙肝易感者，包括婴幼儿、儿童和因职业关系接触乙肝病毒的成年人。但主要接种对象为婴幼儿。接种对象应为乙肝病毒表面抗原阴性和转氨酶正常者，接种于上臂三角肌内。

接种重组酵母乙肝疫苗所产生的抗体与接种血源乙肝疫苗产生的抗体具有类似的免疫学性质和化学性质，这两种乙肝疫苗在健康人群中产生相同的抗体谱，因而这两种疫苗可以互换使用。使用血源性乙肝疫苗进行第一或第一、第二针免疫接种的人，可以用重组酵母疫苗完成第二、三针或第三针免疫接种，反之亦然。

已经患有肝炎、急性传染病或其他严重疾病者禁用。对酵母或疫苗中任何成分过敏者禁用。注射时应备有肾上腺素，当过敏反应发生时使用。每一接种对象必须使用单独的注射器和注射针头，以防止乙肝病毒和其他致病因子的相互传染。用前摇匀，有摇不散块状物不得使用。 3．不良反应

本品一般没有严重的副反应，偶有注射部位红肿或疼痛，发烧或头痛。都为一过性反应。 ［2」重组乙肝表面抗原疫苗（CHO细胞） 简称“乙肝基因疫苗” 1．结构与性质

乙肝病毒包膜蛋白的基因有三个基因序列，共用一个终止密码，因而该基因的翻译蛋白产物有三种：①HBsAg的主蛋白，有226个氨基酸；②中等蛋白，在主蛋白的N端，另有55个氨基酸；③大蛋白，含389400个氨基酸。本品主要是HBsAg的主蛋白，含226个氨基酸。电泳结果表明除有分子量为23000和27000两条特异性蛋白区带外，尚有三条糖蛋白区带即GP30及其二聚体、多聚体，共五条区带，都具有活性。 纯化的HBsAg在CsCI中浮力密度为1.20-1.22，电镜检查HBsAg颗粒是均匀的，有时存在少数大或小的空心颗粒。5＋端氨基酸序列分析结果与编码碱基序列完全相符。 2．临床应用

本品用于预防乙型肝炎。接种对象是乙型肝炎易感者（表面抗原阴性、转氨酶正常），主要用于婴幼

儿。一般易感者（婴儿、儿童和成人）每次注射1ml（10μg），免疫间隔为零月（注射当时）、一月、六月共三针。三针后1个月100％抗体阳转。用于高危病人如肾透析病人及其他与乙肝密切接触者，可用20μg/1ml规格。用于母体HBsAg阳性（特别是e抗原阳性）的新生儿，应在出生后48h内注射，用20μg/1ml规格。注射间隔同上，亦可与乙肝高价免疫球蛋白（HBIG）联合使用。 本品注射时要充分摇均，注射部位为上臂三角肌内。对患有肝炎、发热、急性慢性严重疾病或有过敏史者禁用本品。如有安瓿破裂、变质或有摇不散的块状物不得使用。本品贮存过程中严防冻结。 (B)新型乙型肝炎疫苗

20世纪80年代早期开始的乙型肝炎（HB）疫苗接种无疑取得了巨大成功，在广泛使用疫苗的人群中，HB发病率显著下降，近十几年来，已证明HB疫苗安全有效，具有高度免疫原性，90％以上的接种者达到保护性HBsAb水平，所有成功接种者（HBsAb水平）10U／L）都能抵抗HB。并且该疫苗耐受性良好，从未观察到明显由该疫苗引起的严重不良反应。

然而，HB疫苗的一些缺点阻碍了它的应用。全程免疫需接种3次疫苗，这会降低免疫覆盖率；1％～10％的健康者对疫苗应答不佳，该百分率在老年人中保持恒定；另外，有可能逃避现有疫苗保护作用的HBsAg突变株存在争论。鉴于这些原因，目前正在研制新的更好的HB疫苗，以增强疫苗的免疫原性，简化HB疫苗接种。

［1］改进现有疫苗的方法 1．联合疫苗

HB疫苗可与其他疫苗（尤其是儿童期疫苗）联合使用，这样只需一针注射，其结果元疑会提高免疫覆盖率，HB与DTP或甲型肝炎与乙型流感杆菌（Hib）联合疫苗已有一些国家应用，目前正在开发DTP、HB。脊髓灰质炎和Hib联合疫苗。 2．单剂疫苗

人们正在用控释微粒技术研制单剂疫苗。该法是利用灭活疫苗一针注射诱导强的长期免疫应答。将疫苗包裹于无反应性且能很好耐受的可生物降解聚合物（聚丙交酯—聚乙交酯）中。疫苗依其在这些微球内的分布于不同时间点释放出不同的量，这样可模拟不同时间间隔接种数剂疫苗。动物实验已获成功：1剂含HBsAg的微粒诱导的免疫应答几乎与不同时间接种3剂的常规HB疫苗相同。 3．口服疫苗

含HBsAg编码基因的重组沙门菌实验疫苗可在小鼠中诱导HBsAb应答。今后的方法是研制表达HBsAg的转基因植物（如香蕉等）作为可食用疫苗。 ［2」增强HB疫苗免疫原性的方法 1．新递释系统

目前正在对几种增强HB疫苗免疫原性的方法进行研究。第一种是使用替代的递释系统：正在对新佐剂进行检测，痘苗、腺病毒或沙门菌等重组微生物正在被用作感染后的表达宿主，并诱导其特异性免疫力。 2．新佐剂

为增强免疫缺陷者（如血液透析病人）的免疫应答，用α-干扰素作为常规疫苗的佐剂已取得一定成功，Meuer等将白细胞介素-2与疫苗一起注射的预试研究已取得较好结果。然而，Jungers的大规模对照研究不能证实这些结果。实验性新佐剂单膦酸酯质A的临床试验结果比常规疫苗略好。 3．重组活载体

迄今，对重组活载体只进行过动物实验，Moss等对含HBsAg基因的重组痘苗病毒的试验表明，该疫苗能保护黑猩猩抵抗HB病毒的攻击。然而，痘苗病毒副作用大，不能用于人类。