(1). (2). (3). 4.
强化基因的表达，改善生物性状 关闭特定基因的表达，改善生物性状 基因的异源表达赋予生物新的功能
II型限制性核酸内切酶命名原则：
1. 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。
2. 若该菌有不同的变种或品系，再加上变种或品系的第一个字母，如
EcoRⅠ。
3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制-修复系统，用罗马字母表示，如EcoRⅠ，EcoRⅤ。
4. 限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。(现已省略)
5.
产生星活性的原因及影响其酶活性的因素
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导致星号活性发生的因素
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高甘油含量(>5%，V/V)；
限制酶用量过大(>100U/μg DNA)； 低离子强度(<25mmol/L)； 高pH(>pH8.0)；
含有机溶剂(如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等)； Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价阳离子存在。
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抑制星号活性的方法
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尽量用较少的酶进行完全消化反应，这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度；
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6.
尽量避免有机溶剂的污染； 将离子浓度提高到100-150mM； 将反应缓冲液的pH值降到7.0 ； 二价离子用Mg2+。
DNA连接酶的种类及作用特点
种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、嗜热菌DNA连接酶 DNA连接酶催化的连接反应特点
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连接反应发生在一条DNA链的3’-OH端和另一条DNA链的5’-P端之间；
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连接反应需要ATP或NAD+和Mg2+作为辅助因子与激活因子； DNA连接酶不能催化两单链DNA分子或环化单链DNA分子的连接； 只能连接双链DNA分子的单链缺口(nick)，不能连接双链中的裂口(gap)。
7.
常见工具酶的用途如：
DNA聚合酶：
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补齐5’-突起端 合成第二条cDNA
除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时） 切口移位制备探针
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反转录酶：
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以mRNA为模板合成其互补的DNA(cDNA)，用于构建cDNA和基因克隆；
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对具5’端突出的DNA片段的3’凹端进行补平和标记，制备杂交探针；
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代替Klenow片段或测序酶，用于DNA序列分析。
碱性磷酸酶：
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DNA或RNA分子片段5’末端的去磷酸化，防止自身连接；在5’端标记之前，去除DNA或RNA分子的5’末端磷酸基团。P31-32
末端转移酶：
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用于克隆DNA片段，给载体和外源DNA 3’末端分别加上互补的同聚物尾巴，以便二者在体外连接。
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用于DNA片段3’末端标记，催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端；催化生物素等非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端。
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按照模板合成多聚核糖核苷同聚物。
多核苷酸激酶：
? DNA 5’端磷酸化 ? 标记
8.
DNA或RNA的5’端
质粒的基本性质：
自主复制性、不相容性、转移性、携带特殊的遗传标记
9.
理想质粒载体的必备条件和质粒载体人工构建的策略
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理想质粒载体的必备条件：
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具有较小的分子质量和较高的拷贝数； 具有尽可能多限制酶的单一酶切位点； 具有两种以上的选择标记基因； 缺失mob基因；
插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。
质粒人工构建的策略P39-40
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加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择； 增加或减少合适的酶切位点，便于重组；
缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量； 改变复制子, 变严谨为松弛, 变少拷贝为多拷贝； 根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。 和M13噬菌体的性质
10. λ
λ噬菌体的性质
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是E.coli的温和型噬菌体。
λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性dsDNA分子，两端各有12个碱基(5’-GGGCGGCGACCT-3’)的5’凸出黏性末端是互补的。进入细菌细胞的λDNA通过两端的黏性末端配对形成环状的dsDNA，这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点(cohesive end site)。
? 11. λ
含有60多个基因，整个基因组分为三部分
噬菌体载体的构建与类型、各种载体承载量的大小。
噬菌体载体的构建：
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缩短长度，提高装载量；
删除重复的酶切位点，增加一些单一的酶切位点； 加装选择标记(免疫功能类标记和颜色反应类标记)； 构建琥珀密码子的突变体。
噬菌体载体的类型：P44-45
插入型载体：载体长度37kb，插入片段大小0-14kb（51-37）
置换型载体：载体长度26kb，最小装载长度10kb（36-26），最大装载长度25kb（51-26）
12. 提取和纯化? ? ?
DNA的步骤主要有：
细胞裂解和DNA的溶解与保护；
去除与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质； DNA的沉淀和纯化。
DNA质量：
13. 如何检测、评价提取的
(一)紫外分光光度法测定DNA、RNA的浓度和纯度
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DNA或RNA链上碱基的苯环结构在260nm处有特异的紫外吸收峰，吸收强度不仅与它们总含量有关，还与它们的分子形状、单双链有关。
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可用OD260/OD280值衡量DNA/RNA的纯度
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纯DNA的OD260/OD280应为1.8，大于1.9表明有RNA污染，小于1.6表明有蛋白质或酚污染；同时OD260/OD230应大于2.0，小于2.0表明溶液中有残存的多糖、盐和小分子杂质等。
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纯RNA的OD260/OD280应介于1.7-2.0之间，小于1.7说明有蛋白质或酚的污染，大于2.0表明有异硫氰酸胍残存；同样OD260/OD230应
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