大肠杆菌代谢途径改造策略与应用研究进展

大肠杆菌代谢途径改造策略与应用研究进展

李冉 黄玉清 贾振华

【摘 要】 大肠杆菌由于具有稳定性强和易于操作的特点成为基因改造常用的宿主微生物。利用基因工程手段改造大肠杆菌的代谢途径，可用于生物燃料、手性药物及其衍生物的合成。利用代谢组学和合成生物学能够高效地以大肠杆菌作为生物催化剂生产目标物。综述了大肠杆菌中丙酮酸、乙酰辅酶A、甲羟戊酸和莽草酸代谢途径的改造策略，以及大肠杆菌代谢途径的改造在合成生物燃料、砌块化合物中的应用，为研究者以大肠杆菌合成目标化合物的研究提供一个整体的思路和方法。 【期刊名称】生物技术通报 【年(卷),期】2019(035)008 【总页数】6

【关键词】 大肠杆菌；代谢途径；生物燃料；砌块化合物 【文献来源】

https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_biotechnology-

bulletin_thesis/0201272955670.html

基金项目：河北省科学院项目（181607）

大肠杆菌的代谢组学已研究的很透彻，与其他微生物相比，其自身的代谢途径更加稳定且易于改造，因此大肠杆菌作为一种工业微生物被广泛应用于代谢途径改造的研究。目前对大肠杆菌改造的研究集中在四条主要代谢途径，包括丙酮酸、乙酰辅酶A、甲羟戊酸和莽草酸代谢途径，用于醇类、有机脂肪酸、氨基酸、类异物二烯和芳香族化合物的合成。

大肠杆菌的系统代谢工程在生物燃料和砌块化合物的合成中均有研究和应用，

它将整个生物过程的系统生物学和合成生物学相结合，有助于制定有效的策略改造微生物菌株，以便使目标化学品的生产产量和生产效率最大化，同时使整个上游和下游的工艺成本最小化。常用的技术主要包括自身代谢途径的基因敲除、过表达以及导入新的代谢途径。

本文综述了大肠杆菌系统代谢工程在自身代谢途径改造策略，在生产生物燃料、砌块化合物的微生物开发中所使用的工具和策略，以期为研究者以大肠杆菌合成目标化合物的研究提供一个整体的思路和方法。

1 大肠杆菌代谢途径的改造

1.1 丙酮酸代谢途径改造

丙酮酸是一种重要的有机中间体，可被用作L-色氨酸、L-酪氨酸和二羟基苯丙氨酸等药物的合成，也可用于阿托酸、丙酮酸乙酯等农药中间体的合成［1］。在大肠杆菌中，丙酮酸是糖酵解途径中重要的代谢中间体，可用于乳酸、丙氨酸、醋酸酯和乙酰辅酶A的合成，也可用于乙二醇、2，3-丁二醇和异丁醇等的合成［2-3］。目前对丙酮酸途径的改造主要有3种方式，第一，降低丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate dehydrogenase complex，PDHC）的活性，PDHC由3个亚基组成，包括aceE基因编码的EI亚基，即丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase）；aceF基因编码的E2亚基，即二氢硫辛酰胺转乙酰酶（Dihydrohpoamide transacetylase）；IpdA基因编码的E3亚基，即二氢硫辛酰胺脱氢酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase）。宋灿辉等［4］利用 Red重组系统构建了营养缺陷型菌株MG1655，敲除大肠杆菌PDHC中的aceE基因后，阻断了丙酮酸流向TCA循环，促进丙酮酸的累积。第二，降低α-酮戊二酸脱氢酶复合体（α-ketoglutarate dehydrogenase complex，

AKGDH）的活性，AKGDH由3个亚基构成，包括sucA编码的E1亚基，即α-酮戊二酸脱羧 酶（α-ketoglutaratedecarboxylase，KCBX）；sucB基因编码的E2亚基，即硫辛酰转琥珀酰酶（Lipoyl transsuccillylase，LTS）及IpdA基因编码的E3亚基。Causey等［5-6］通过敲除atpFH、adhE、sucA基因来降低ATP合成、细胞生长和CO2产生的速率，从而加强从葡萄糖到丙酮酸的积累。第三，减少丙酮酸代谢支路，减少丙酮酸的消耗。大肠杆菌YYC202是一种被成功改造的用于丙酮酸积累的营养缺陷型菌株，突变了其中编码丙酮酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、丙酮酸甲酸裂解酶和丙酮酸氧化酶的基因，去除了可以消耗丙酮酸的下游代谢［7-8］。从目前的研究可以看出，促进大肠杆菌中丙酮酸的积累主要有两个策略，首先是提高丙酮酸的合成速度，降低反馈抑制调节；其次是去除丙酮酸的代谢支路，减少丙酮酸消耗。 1.2 乙酰辅酶A代谢途径改造

乙酰辅酶A是微生物自身代谢中重要的中间体，它既是TCA循环的起始化合物，也是脂肪酸合成的前体。通过丙酮酸盐，乙酰辅酶A可被转化为多种化学物质，包括1-丁醇、丁酸酯、S-3-羟基丁酸酯和聚 3-羟基丁酸酯［9-13］。

实现乙酰辅酶A的积累可通过两种方式，一是调节PDHC的活性，在有氧条件下，PDHC可将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，但是PDHC在缺氧或无氧条件下活性较低，为了解决这个问题，Kim等［14］将编码PDHC基因中的lpdA基因进行突变（将E354突变成K），使其在缺氧条件下保持活性。Boldt等［15］将肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumonia）中的lpdA基因突变（将D354突变成K）后，替换大肠杆菌中的lpdA 基因，结果表明基因改造后的大肠杆菌可在氧含量较低的环境中生长，提高了菌体积累乙酰辅酶A的能力。二是代