pDsRED-LC3真核表达载体的构建及其在肝癌细胞系
HepG2中的表达和定位
彭琬昕，孙瑶湘，陈 琛，金 洁，邵根宝，王 嫘
【摘 要】［摘 要］ 本实验根据已知的人MAP-LC3序列，以人脑胶质瘤U251细胞cDNA为模板扩增出去除终止密码子的MAP-LC3片段，定向克隆至红色荧光融合蛋白载体pDsRed-N1质粒中，构建了重组质粒pDsRed-LC3．将pDsRed-LC3转染HepG2细胞，48 h后用Western Blot、激光共聚焦显微镜检测融合蛋白在细胞内的表达和分布情况，并观察血清饥饿时细胞发生自噬的情况．结果表明:(1)成功构建pDsRFP-LC3真核表达载体，该载体能在人肝癌细胞中表达;(2)血清饥饿应激实验证明，该载体可以良好地指示自噬泡的形成过程，为研究肿瘤细胞的自噬发生情况提供了一个重要而方便的工具． 【期刊名称】南京师大学报（自然科学版） 【年(卷),期】2012(035)001 【总页数】5
【关键词】［关键词］ 红色荧光蛋白，MAP-LC3，自噬，肝癌
细胞自噬(Autophagy)是真核生物进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程，是由比利时科学家Christian de Duve在上世纪70年代首次发现并命名．相对于主要降解短半衰期蛋白质的泛素－蛋白酶体系统，细胞的自噬被认为是参与绝大多数长半衰期蛋白质的降解，清除细胞内受损伤的细胞结构、衰老的细胞器，以及不再需要的生物大分子等，并产生氨基酸、游离脂肪酸等中间产物以供新的蛋白质和能量的合成，使细胞能够适应缺氧和饥饿等恶劣环境［1-3］．近年来许多研究表明，自噬对于肿瘤细胞的存活率以及放化疗耐受性
都具有一定的影响，但其分子机制及生物学效应仍在探索中［4，5］．
微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP-LC3)是哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因ATG8的同源物，LC3-II定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，常作为自噬的特异性标志物［6］．LC3的表达、LC3-II与LC3-I蛋白的比值，常常作为检测细胞自噬是否启动的关键指标［7］．本实验通过构建LC3与红色荧光蛋白(RFP)的融合蛋白，在荧光显微镜下可以观察到LC3在细胞中的定位、动态观察自噬的发生过程，确认该蛋白在自噬功能研究中的可用性，为深入开展自噬在肝癌细胞病理进程中的机制研究提供一种新的实验工具．
1 材料与方法
1.1 材料
1.1 ．1 质粒和细胞
pDsRed-N1真核表达载体由南京大学医学院李朝军教授馈赠，人肝癌细胞HepG2购自中国科学院上海细胞库．HepG2细胞接种于含非必须氨基酸MEM培养液中，10%胎牛血清，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养至对数生长期． 1.1.2 主要试剂
Marker、Pyrobest Taq酶、Bg lII、Hind III和T4连接酶均购自大连宝生物公司，PCR产物琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒均购自北京全式金(Transgen)公司，MEM、非必须氨基酸、Lipofectin 2000购自美国Invitrogen公司，鼠抗人β-actin单克隆抗体购自美国Sigma公司，兔抗MAP-LC3多克隆抗体购自美国Abcam公司，兔抗RFP单克隆抗体购自美国
Biovision公司，增强型化学发光试剂(ECL)购自美国Pierce公司．1.2 方法 1.2.1 重组表达质粒的构建及鉴定
以人脑胶质瘤细胞U251 cDNA为模板，根据人LC3序列设计引物，上游引物带Bg lII酶切位点，其序列为5'-GGAAGATCTATGCCCTCAGACCGGCCTT-3'，下游引物带Hind III酶切位点，并且不含有终止密码子，其序列为:5'-CCCAAGCTTGAAGCCGAAGGTTTCCTGG-3'，用pfu高保真聚合酶进行PCR反应(94℃，50 s;55℃，30 s;72℃，2min;循环30次)，扩增片段大小为366 bp．将PCR产物用Bg lII、Hind III过夜酶切，次日电泳胶回收、纯化PCR产物，随后与用相同内切酶消化的pDsRed-N1载体片段按分子比3∶1(mol/mol)混合，在T4 DNA连接酶催化下，于室温连接3 h后，转化DH5α感受态细胞．将转化液涂布于含50 mg/mL卡那霉素的LB琼脂板上，37℃孵育过夜．随机挑取单菌落摇菌，小量提取质粒DNA，双酶切鉴定，并以重组体为模板、应用上述PCR引物对重组体进行PCR鉴定．酶切及PCR鉴定产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并在凝胶图像分析仪上成像．对初步鉴定为正确的重组体进行DNA序列分析(由南京金斯瑞公司完成)，将构建的重组质粒命名为pDsRed-LC3．
1.2.2 重组表达质粒的转染及融合蛋白的表达检测
按8×105个细胞/孔，将HepG2细胞接种于6孔板中，待细胞融合至80%时参照Lipofectin 2000说明书进行转染，设未转染组、空载体对照组和实验组．24 h后分别收集细胞总蛋白，将蛋白煮沸5min使其变性，取处理后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，抗MAPLC3多克隆抗体(1∶3 000)或抗RFP抗体(1∶2 000)或抗β-actin抗体
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