目的：发现与A相互作用的motif
方法：以构建到pGADT7载体上的A基因为诱饵，筛选酵母单杂交motif文库，经过对阳性克隆的基因检测、DNA测序和比对分析，确定与pGADT7-A相互作用的motif。
材料：
1．诱饵克隆：pGADT7-A 2．诱饵载体：pGADT7 3．文库酵母质粒：motif 4．Clontech酵母单杂交系统 5．培养基：
1). 大肠杆菌培养基：
LB：0.5% Yeast extract，1% Polypeptone，1% NaCl。 2). 酵母完全培养基：
YPDA：1% Yeast extract，2% Tryptone，2% Glucose, 0.02% Adenine。 3). 酵母缺陷型筛选培养基：
参照Clontech公司的PT3024-1/Yeast Protocols Handbook。其中各种培养基分别以下列符号表示：
SD-L：-leu；SD-TL：-trp, -leu；SD-LH：-leu, -his；SD-TLH：-trp, -leu, -his。 4). 其他贮备液：
10×TE：0.1 M Tris-HCl（pH7.5），10 mM EDTA，高压灭菌； 10×LiAc：1 M LiAc (pH7.5)，高压灭菌；
第一部分将诱饵质粒转化受体菌Y187中及其自激活检测 1.1酵母转化
将以下质粒分别转入Y187中：
Reaction 1 2
pGADT7-A pGADT7-A AD plasmid
类
SD-L SD-TL
筛库备用 自激活检 测
SD-TL
阳性对照
涂板种
备注
+pHIS2-p53 3
1.2 酵母转化方法
pGAD53m +pHIS2-p53
1. 从YPDA平板挑取Y187单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5。
2. 转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6。
3. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
4. 用20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 5. 用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
6. 用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，每个50 ul（每个转化），备用。
7. 每个1.5 ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350
240 ul
1 M LiAc
36 ul
ssDNA mg/ml)
5 ul
(20
质粒DNA
各5 ul
8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏，30 min。
11. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
12. 每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。
13. 30℃恒温培养4天。
1.3自激活检测
pGADT7-A+pHIS2-p53、pGAD53m+pHIS2-p53转化到Y187，涂到SD/-Trp/-Leu平板，30℃恒温培养3-5 d。随机挑取6个点用载体引物进行PCR验证，随机取了三个正确的克隆混合后，调整OD600至0.002，做梯度稀释（100、10-1、10-2），点板于对应的不同浓度（0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mM）3AT的缺陷型平板上，30℃恒温培养3天。3AT是酵母HIS3蛋白合成的竞争性抑制剂，用于抑制HIS3基因的泄漏表达。
结果如下：
图1. 自激活检测结果
从图中看出70 mM浓度下还有少量的菌长出，而80 mM浓度下没有菌生长。 结论：选用80 mM 3AT进行后续筛库浓度。 第二部分文库筛选
用含有pGADT7-A诱饵质粒的Y187酵母菌株作为受体菌制备感受态，将motif文库质粒转入其中，涂布于含80mM 3AT的SD-TLH筛选平板。
2.1文库DNA转化方法：
1. 从SD-L平板挑取单菌种接于液体SD-L培养基50 ml，30℃，225 rpm，振荡培养24 h。
2. 转接于YPDA液体500 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6。
3.离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
4.用30 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 5.用20 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
6.用10 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清。
7.向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350
1 M LiAc
1.44 ml
ssDNA (10 mg/ml)
文库质粒DNA
9.6 ml 300 ul 25 ug
8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏1 h。
11.离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清，用6 ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20 ul培养物稀释后涂SD-TL平板，用于检测文库转化效率。其余涂80mM 3AT的SD-TLH平板20块。
12. 30℃恒温培养3-7天，观察菌落生长 第三部分酵母阳性克隆鉴定及测序比对
为了鉴定80mM 3AT的SD-TLH平板中筛选到的阳性克隆分别是什么motif，需要将这些阳性克隆从酵母细胞中扩增出来进行DNA测序，并将测序序列进行比对分析。
注：扩增阳性克隆使用的是南京瑞源生物技术有限公司自主研发的一款快速扩增酵母阳性克隆试剂盒(Yeast Colony Rapid Detection Kit，货号：RY8001)。
测序比对结果
挑选48个阳性酵母克隆，全部PCR扩增，有条带的15个，测序成功10个，经过比
对，最终获得6个不同序列的motif。（比对结果见附件）
第四部分酵母阳性克隆回转验证
将上述划线于80 mM 3AT的SD-TLH平板上长出的阳性克隆转化子，用无菌水稀释后点至SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+80 mM 3AT平板，30℃恒温培养3-4天。
结果如下：
图2.回转验证结果
回转验证结果：
筛选得到的6种motif能在SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+80 mM 3AT平板上生长。 南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2024年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。目前已经成熟的产品线如下:酵母文库的构建、酵母双杂交筛选体系酵母单杂交筛选体系、酵母菌落快速鉴定试剂盒、酵母质粒快速抽提试剂盒、蛋白质免疫沉淀检测服务、酵母体系非生物胁迫抗逆性筛选以及 CUT&Tag服务等。
新-TF-centered Y1H筛选与转录因子A相互作用的motif实验结题报告
