生化综合实验报告--测定蛋白质含量的三种方法及其比较

本科学生综合性实验报告

学号 姓名 学院 专业、班级

实验课程名称 测定蛋白质含量的三种方法及其比较 教师及职称

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云南师范大学教务处编印

一．实验设计方案

实验序号 十~十实验名称 测定蛋白质含量的三种方法及其比较 二 实验时间 2012/11/16~2012/11/30 实验室 睿智楼3幢331（生物技术实验室4） 1．实验目的： ⑴掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。 ⑵掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法。 ⑶掌握紫外吸收法定量测定蛋白质含量的原理和方法。 ⑷比较三种定量测定方法的异同。 2． 实验原理、实验流程或装置示意图 （1）双缩脲法 (Biuret 法)测定蛋白质浓度 原理：在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与Cu2+作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。具有两个或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用比色法测定蛋白质的浓度。 在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。测定范围为1~10mg蛋白质。 （2）考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度（ Bradford 法） 原理：考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250（coomassie brilliant blue，CBB）在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质.色素结合物在595 nm波长下的光吸收符合比尔定律，故可用于蛋白质的定量分析。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合2min左右达到平衡。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量。 （3）紫外吸收法测定蛋白质浓度 原理：白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（O.D280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 3．实验设备及材料 （1）双缩脲法 实验器材： ①容量瓶 ②试管、试管架 ③恒温水浴槽 ④吸量管 ⑤分光光度计 ⑥电热套 ⑦锥形瓶 ⑧比色皿 实验试剂： ①标准酪蛋白溶液: 用0.05 mol/L NaOH溶液配制。酪蛋白要预先测定其蛋白质纯度，再根据其纯度配制成标准溶液。也可用牛血清蛋白或卵其清白蛋白配制标准蛋白溶液。 ②双缩脲试剂: 溶解1.5g CuSO4·5H2O和6.0g NaKC4H4O6·4H2O于500ml蒸馏水中，在搅拌下加入300 ml 10% NaOH溶液，用蒸馏水定容到1升刻度，混匀备用。?? ③蛋白质样品或蛋白质样品溶液。 (2) 考马斯亮蓝染色法 试剂: ①考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 ml。 ②标准蛋白质溶液: 牛血清蛋白或卵其清白蛋白等，预先测定其蛋白纯度，再根据纯度用蒸馏水或0.9％NaCl 准确配制。 器材: ①容量瓶 ②试管及试管架 ③恒温水浴槽 ④吸量管 ⑤分光光度计 ⑥电热套 ⑦锥形瓶 ⑧比色皿 (3) 紫外吸收法 试剂: 样品蛋白溶液:准确称样品蛋白质,配制成一定浓度的溶液。 器材: ①紫外分光光度计 ②容量瓶 ③试管、试管架 ④吸量管 ⑤锥形瓶 ⑥比色皿 4．实验方法步骤及注意事项 双缩脲法 标准曲线的绘制: 取12支试管分成两组，按下表平行操作，绘制标准曲线。 管 号试 剂0123451.003.0标准蛋白溶液00.20.40.60.8（ml）1.00.80.60.40.2蒸馏水（ml）3.03.03.03.03.0双缩脲试剂（ml）充分混匀后，室温下（20 ~25℃）放置30min测定O.D540 O.D540标准蛋白质浓度 （mg/ml）样品测定: ①制备样品的蛋白质提取液。

②取出两份1.0 ml样品液。操作同标准曲线，测定样品的OD值，平行两份 计算: 取两组测定的平均值计算。 从标准曲线上查出其蛋白质浓度，再根据样品称重量和稀释倍数计算样品的蛋白质含量。 注意事项： Tris 、铵盐对测定有干扰，有大量脂肪性物质同时存在时，会产生混浊的反应混合物。 考马斯亮蓝染色法 标准曲线的制作 ① 取12支试管，按下表加入试剂 管号试剂标准蛋白质0.9%NaCl考马斯亮蓝蛋白质浓度(μg/ml)O.D595 1 0 2 0.1 3 0.2 0.3 3.0 4 0.3 0.2 3.0 5 0.4 0.1 3.0 6 0.5 0 3.0 1.0 0.4 3.0 3.0 ② 混匀，室温静置３min，以第１管为空白，于波长595nm处比色，测定OD值， 以的OD值为纵坐标，各标准液浓度为横坐标作标准曲线 。 未知样品蛋白质含量的测定 准确吸取0.5 ml所制备的蛋白质样品稀释液，加入3.0 ml考马斯亮蓝G-250试剂后，所有的操作完全与标准曲线相同，测定样品的OD值。平行两份。从标准曲线上查出其蛋白质浓度，再根据稀释倍数计算样品的蛋白质含量。 注意事项： 大量去污剂的存在对颜色影响太大不易消除。 紫外吸收法 ①280nm与260nm的吸收差法 将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm和280nm处分别测出O.D值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。

计算: 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45O.D280— 0.74O.D260 ②校正因子法 先计算出O.D280/O.D260的比值后，从下表中查出校正因子为“F”值，将“F”值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。 蛋白质浓度（mg/ml）= F×1/d×O.D280×N 式中，d为石英比色皿的厚度（cm）；N为溶液的稀释倍数。 紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子 280/2601．751．631．521．401．361．301．251．161．091．030．9790．9390．874核酸/（%）因子（F）0．000．250．500．751．001．251．502．002．503．003．504．005．001．1161．0811．0541．0230．9940．9700．9440．8990．8520．8140．7760．7430．682280/2600．8460．8220．8040．7840．7670．7530．7300．7050．6710．6440．6150．595核酸/（%）因子（F）5．506．006．507．007．508．009．0010．0012．0014．0017．0020．000．6560．6320．6070．5850．5650．5450．5080．4780．4220．3770．3220．278 注意事项： 若样品中含有大量吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。 5.实验数据处理方法 双缩脲法 管 号 试 剂 0 1 2 3 4 5 样品1 样品2 O．D540 标准蛋白质浓度(mg/ml） 0 0.021 0.052 0.160 0.316 0.345 0.08 0.029 0 1 2 3 4 5 X Y