D4 操作步骤
D4.1 采样及样品处理
样品采集后应立即送到实验室检验。若不能立即检验时，可在 100g 污泥中加入 5mL3%
福尔马林或 3%盐酸溶液，在 4～10℃冰箱内保存。若样品为经过氯消毒的污泥，应在现场取
样后立即用 5％硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。 D4.2 蛔虫卵收集 D4.2.1 分离
将 100g 污泥样品和 50mL5％氢氧化钠溶液，分别注入三角烧杯内，置于振荡器上，以
200～300 次/min 速度振荡 30min，然后静置 30min，以使蛔虫卵不再粘附在污泥上。 D4.2.2 水洗
将上述样品分装在离心管内，以 2000～2500 转/min 的转速离心 5min。倒去离心管上
部的液体，加入容量为沉淀物 10 倍的蒸馏水，混匀，以 2000～2500 转/min 的转速离心 5min， 如此反复数次，直至沉淀物上面的液体接近透明。 D4.2.3 漂浮
离心管内注入饱和硝酸钠溶液或饱和氯化钠溶液，搅匀，以 2000～2500 转/min 的转 速离心 5min。
注 1：由于蛔虫卵的相对密度小于饱和硝酸钠溶液和饱和氯化钠溶液的相对密度，管内绝大多数的
蛔虫卵会浮聚在液面上。
注 2：氯化钠溶液投加量以大于沉淀物量 20 倍为宜。 注 3：根据污泥性状，可以调整离心转速或时间。
D4.2.4 沉淀
反复吸取管中浮膜转移至另一离心管中，加入 10 倍水量的蒸馏水，搅匀，以 5000 转/min 的转速离心 5min，慢慢吸去上清液。
注：由于蛔虫卵比水的相对密度大，蛔虫卵将沉在管底内。
D4.3 培养
在离心管中，加入 2～3mL 无菌的生理盐水或自来水和几滴 3％福尔马林溶液，摇匀， 转移至试管或直接置于 24～26℃恒温箱，培养 20 天。培养中，若溶液量少于 2mL 时，应及 时补充生理盐水或自来水。 D4.4 镜检
培养后，将样品静置 30mL 后吸去试管内上层较浑浊的液体，加入约为沉淀物两倍量的 蒸馏水或 30％次氯酸钠溶液，混匀，在显微镜下计数死活蛔虫卵数。
注 1：活虫卵经过 20 天的培养会逐渐发育到幼虫期，而死虫卵则在同一条件下仍然保持单细胞期或停 留于某一发育阶段，故可以区别。
注 2：30％次氯酸钠溶液能使虫卵最外层蛋白质壳逐渐溶解，便于在显微镜下清晰观察卵内的幼虫。
D5 蛔虫卵死亡率计算
按下式计算蛔虫卵死亡率：
m A =m+ n100 ×公式中：A——蛔虫卵死亡率（%）； m——死亡蛔虫卵数； n——存活蛔虫卵数 D6 检验结果报告
根据检验结果，报告 100g 污泥中蛔虫卵死亡率。
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附录 E
(规范性附录)
医疗机构污水和污泥中结核杆菌的检验方法
E1 仪器和设备 E1.1 电炉。
E1.2 恒温水浴箱。 E1.3 高压蒸汽灭菌器。 E1.4 滤菌器。 E1.5 离心机。 E1.6 恒温培养箱。
E1.7 乙酸纤维膜：孔径为 0.3～0.7μm E1.8 玻璃漏斗 G2：孔径为 10～15μm E1.9 玻璃漏斗 G4：孔径为 3～4μm E1.10 酒精灯
E2 培养基和试剂： E2.1 改良罗氏培养基 E2.1.1 成分
磷酸二氢钾 2.4g 硫酸镁 0.24g 枸橼酸镁 0.6g 谷氨酸钠 1.2g 甘油 12mL 淀粉 30g
蒸馏水 600mL
鸡蛋液（包括蛋清和蛋黄） 1000mL 20%孔雀绿 20mL E2.1.2 制法
将磷酸二氢钾、硫酸镁、枸橼酸钠、谷氨酸钠、甘油及蒸馏水混合于烧杯内，放在沸水 浴中加热溶解。加入淀粉继续加热 1h，摇动使其溶解，待冷却至 50℃加鸡蛋液及孔雀绿， 溶解，混匀。制成斜面，保持温度 90℃，灭菌 1h。 E2.2 小川氏培养基 E2.2.1 成分
甲液：无水磷酸二氢钾 1g
味精 1g 蒸馏水 100mL 乙液：全蛋液 200mL
甘油 6mL 2%孔雀绿 6mL
E2.2.2 制法
甲、乙两液混合分装试管内。制成斜面，保持温度 90℃灭菌 1 h。 E2.3 pH 为 7.0 的磷酸盐缓冲液(M／15)
E2.4 10％吐温(Tween)80 水溶液加等量 30％过氧化氢溶液。 E2.5 4％硫酸溶液 E3 检验程序
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结核杆菌检验程序见图 E。
污水集菌：过滤离心法或直接离心法 污泥集菌：过滤离心法 培养：接种于罗氏培养基或小川氏培养基 37℃、培养8周 初步鉴定：对可疑菌落作抗酸染色，染色阳性者再作分离传代
28℃、培养2～4周 鉴定：致病力试验 检验结果报告
图 E 结核杆菌检验程序
E4 操作步骤 E4.1 集菌
污水集菌可采用过滤离心法或直接离心法,污泥集菌可采用过滤离心法。 E4.1.1 污水样品
过滤离心法：用经煮沸消毒的乙酸纤维滤膜(孔径 0.3～0.7μm)抽滤，安装严密后，取
污水样 500mL 抽滤，根据悬浮物的多少，一份水样需更换数张滤膜，将同—份水样滤膜集中 于小烧杯内。根据滤膜的多少用 100～200mL4％硫酸溶液反复冲洗，静置 30min 后，收集洗 液于离心管中，3000 转／min，离心 30min，弃去上清液，沉淀物中加 1mL 灭菌生理盐水混
合均匀后，供接种用。
直接离心法：水样 500mL，分装于 50mL 或 200mL 灭菌离心管中，3000 转／min，离心 30min。同一份水样的沉淀物集中于试管内，加等量 4％硫酸处理 30min，供接种用。如体积
过大，再次离心浓缩后接种。
注：若样品为经过氯消毒的污水，应在采样后立即用 5％硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。
E4.1.2 污泥样品
过滤离心法：取污泥 10g 加 100mL 蒸馏水冲洗过滤(滤纸漏斗)，再经玻璃漏斗 G2(孔径 10～15μm)和 G4(孔径 3～4μm)抽滤，最后经滤膜(孔径 0.45～0.7μm)抽滤。取下滤膜，
用 4%硫酸 3mL，充分振摇冲洗 30min。
注：若样品为经过氯消毒的污泥，应在采样后立即用 5％硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。
E4.2 接种
污水的集菌液：全部接种于改良罗氏培养基或小川氏培养基培养管内斜面上，每支培养 管接种 0.1mL。
污泥的集菌液：吸取两个 0.1mL，分别接种于改良罗氏培养基或小川氏培养基培养管内
斜面上。 E4.3 培养
已接种的培养基置于 37℃培养箱内培养。培养 2 周后开始观察结果，每周观察 2 次。
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一般需要培养 8 周。
分离菌株：在罗氏培养基上呈淡黄色或无色的粗糙型菌落，作抗酸染色，阳性者作分离
传代。分离传代菌株如生长速度在两周以上，则需作菌型鉴定；应用耐热触酶试验和传代培
养于 28℃培养 2～4 周，观察是否生长，用此方法即可进行初步鉴定。 E4.4 致病力试验
耐热触酶反应阴性，28℃不生长之菌落为可疑结核杆菌。于小白鼠尾静脉接种 lmg 菌量 (5mg／mL 菌液，每只动物接种 0.2mL)，死亡时观察病变或 8 周后解剖脏器发现典型结核病 变者可确认为检出结核杆菌。其耐热触酶试验方法如下：
取菌落 3～5 mg 分散于 0.5mL 磷酸盐缓冲液中，置 68℃水浴中 20min 后取出．冷却后 加吐温 80h 和过氧化氢溶液混合液 0.5mL。
发生气泡为阳性，30min 不产生气泡者为阴性。人型、牛型结核杆菌，胃分枝杆菌和海 鱼分枝杆菌为阴性，其他非典型抗酸菌和非致病抗酸菌为阳性。人型、牛型结核杆菌在 28 ℃培养不生长，胃分枝杆菌和海鱼分枝杆菌 28℃培养能生长。 E5 检验结果报告
根据检验结果，报告一定体积的样品中存在或不存在结核杆菌。
附录 F
(规范性附录)
医疗机构污水污染物（COD、BOD、SS）单位排放负荷计算方法
F1 水污染物单位排放负荷计算公式：
L= C×Q/N 式中：
L---水污染物排放单位负荷（g/床.d ） C---污染物排放浓度（mg/L） Q---日排水量（m/ d） N---床位数（床）
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GB18466-2005《医疗机构水污染物排放标准》
