马铃薯ACS基因克隆及生物信息学分析
刘 英1,2,裴瑞芳1,2,王 洁1,2,张 宁2,司怀军1,2,王 蒂1 【摘 要】摘要:1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxlic acid synthetase,ACS)是乙烯合成途径中的限速酶,为明确其基因结构为目标,根据已报道的基因序列信息,用马铃薯栽培品种‘甘农薯2号’试管苗作为材料,提取叶片总RNA,设计基因特异性引物,利用RT-PCR克隆出ACS基因,并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析.结果表明:ACS基因CDS区长1 461bp,编码486个氨基酸,ACS蛋白分子量约为55kU,PI 6.76;具有12个alpha螺旋区域,22个beta片层区,32个转角和23个自由卷曲区;具有39个疏水区和41个亲水区;同源性分析表明ACS基因在高等植物中保守性较高. 【期刊名称】甘肃农业大学学报 【年(卷),期】2015(000)001 【总页数】5
【关键词】马铃薯;基因克隆;ACC合成酶;生物信息学分析
乙烯作为一种植物气体激素,对植物种子萌发、生长发育、植物衰老、果实成熟等有明显的影响,并参与了从种子萌发到成熟衰老一系列生命过程的调节.同时与植物逆境胁迫如机械伤害、冷害、渍水、病原入侵等方面有关[1,2],在接种晚疫病后 ACS表达量显著升高[3];此外,乙烯还参与植物细胞的程序性死亡,促进花凋谢和DNA降解.有报道称乙烯与马铃薯块茎萌发有密切关系[4],控制乙烯的生物合成就可以提前或推迟发芽时期,从而来延长或缩短马铃薯块茎休眠时间.
在高等植物体内,乙烯合成需要2个关键酶[5]:ACC合成酶(ACC synthase,ACS)和 ACC氧化酶(ACC oxidase,ACO).ACC合成酶是整个乙烯合成途径中的限速酶,催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclo-propane-1-carboxylic acid,ACC),ACC在 ACC氧化酶作用下产生乙烯[6].ACC合成酶(ACS)是以磷酸吡哆醛为辅酶,可能存在于植物胞质中,存在形式有单体、二聚体和三聚体3种形式,其中单体ACS活性较高,在反应中不易失活[7].受多种因素调控,在植物组织中含量很低,因此分离纯化比较困难.
研究表明,ACS有许多基因编码,其中在番茄(Lycopersicon esculentum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分别分离到9个和12个,而苹果(Malusxdomestica)中也至少存在4个该基因成员[8-9].目前已经从番茄、苹果、康乃馨、豇豆、笋瓜、冬瓜、桃、猕猴桃、香蕉、柑橘、哈密瓜、柿、玫瑰、菠萝、枇杷还有拟南芥中克隆出ACS基因[10].
本研究克隆了马铃薯ACS基因cDNA全长序列,并利用生物信息学软件分析ACS基因结构,而且预测了ACS基因编码蛋白的物理性质,为下一步利用基因工程技术,通过正义过表达和RNAi调控ACS合成,进而调控乙烯对马铃薯块茎休眠的生理效应,延长或缩短马铃薯块茎休眠时间奠定了一定基础.
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
马铃薯四倍体栽培品种‘甘农薯2号’试管苗、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室保存.PMD18-T载体、T4连接酶和 LA Taq DNA 聚合酶、SacⅠ、BamH Ⅰ、XhoⅠ、XbaⅠ等限制
性内切酶均购于TaKaRa公 司;RNA simple Total RNA kit购 自TIANGEN公司;M-MLV逆转录酶、胶回收试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司,引物也由该公司合成.其他试剂均为国产或进口分析纯试剂. 1.2 试验方法
1.2.1 马铃薯叶片总RNA提取与cDNA合成利用植物总RNA提取试剂盒提取马铃薯试管薯叶片总RNA,各步骤均按试剂盒说明书进行.用琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA质量,并选用高质量的RNA进行下游试验.利用M-MLV逆转录酶合成cDNA第1链,具体操作过程参照试剂盒说明书.cDNA保存于-20℃,用于后续试验.
1.2.2 马铃薯ACS基因引物设计及克隆 通过已报道的马铃薯 ACS 基因(序列号为PGSC0003DMT400014932)的序列,利用 Primer 5.0设计PCR引物Ps(上游引物F:GGGATCC(BamH Ⅰ)AAATGGGGTTAATTTCAG;下游引物R:CGAGCTC(SacⅠ)GAACATCACGATTAATTC),由上海生物工程技术服务有限公司合成.其中ACS上下游引物分别添加BamH Ⅰ、SacⅠ酶切位点. PCR反应体系为25μL,10×LA Taq Buffer 2.5μL,dNTP Mixture(2.5mmol/L)4μl,上、下游引物各1μl,模板cDNA 2μL,LA Taq聚合酶0.25μL,ddH2O 14.25μL.反应条件为:94℃预变性3min;94 ℃变性45s,58℃退火1min 30s;72℃延伸1min 30s,35个循环;72℃延伸10min.目的产物用琼脂糖凝胶电泳检测,经回收纯化,克隆到PMD18-T载体上,选择阳性克隆,经PCR、酶切验证正确后送上海生物工程技术服务有限公司测序. 1.2.3 基因生物信息学分析 依据ACS核苷酸和氨基酸序列,利用DNAMAN,DNAstar等生物信息学软件进行分析.利用NCBI和DNAMAN完成核算及氨
马铃薯ACS基因克隆及生物信息学分析
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