马铃薯ACS基因克隆及生物信息学分析
刘 英1，2，裴瑞芳1，2，王 洁1，2，张 宁2，司怀军1，2，王 蒂1 【摘 要】摘要：1－氨基环丙烷－1－羧酸合成酶（1－aminocyclopropane－1－carboxlic acid synthetase，ACS）是乙烯合成途径中的限速酶，为明确其基因结构为目标，根据已报道的基因序列信息，用马铃薯栽培品种‘甘农薯2号’试管苗作为材料，提取叶片总RNA，设计基因特异性引物，利用RT－PCR克隆出ACS基因，并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析.结果表明：ACS基因CDS区长1 461bp，编码486个氨基酸，ACS蛋白分子量约为55kU，PI 6.76；具有12个alpha螺旋区域，22个beta片层区，32个转角和23个自由卷曲区；具有39个疏水区和41个亲水区；同源性分析表明ACS基因在高等植物中保守性较高. 【期刊名称】甘肃农业大学学报 【年(卷),期】2015(000)001 【总页数】5
【关键词】马铃薯；基因克隆；ACC合成酶；生物信息学分析
乙烯作为一种植物气体激素，对植物种子萌发、生长发育、植物衰老、果实成熟等有明显的影响，并参与了从种子萌发到成熟衰老一系列生命过程的调节.同时与植物逆境胁迫如机械伤害、冷害、渍水、病原入侵等方面有关［1，2］，在接种晚疫病后 ACS表达量显著升高［3］；此外，乙烯还参与植物细胞的程序性死亡，促进花凋谢和DNA降解.有报道称乙烯与马铃薯块茎萌发有密切关系［4］，控制乙烯的生物合成就可以提前或推迟发芽时期，从而来延长或缩短马铃薯块茎休眠时间.
在高等植物体内，乙烯合成需要2个关键酶［5］：ACC合成酶（ACC synthase，ACS）和 ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）.ACC合成酶是整个乙烯合成途径中的限速酶，催化S－腺苷甲硫氨酸（SAM）产生1－氨基环丙烷－1－羧酸（1－aminocyclo－propane－1－carboxylic acid，ACC），ACC在 ACC氧化酶作用下产生乙烯［6］.ACC合成酶（ACS）是以磷酸吡哆醛为辅酶，可能存在于植物胞质中，存在形式有单体、二聚体和三聚体3种形式，其中单体ACS活性较高，在反应中不易失活［7］.受多种因素调控，在植物组织中含量很低，因此分离纯化比较困难.
研究表明，ACS有许多基因编码，其中在番茄（Lycopersicon esculentum）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）中分别分离到9个和12个，而苹果（Malusxdomestica）中也至少存在4个该基因成员［8－9］.目前已经从番茄、苹果、康乃馨、豇豆、笋瓜、冬瓜、桃、猕猴桃、香蕉、柑橘、哈密瓜、柿、玫瑰、菠萝、枇杷还有拟南芥中克隆出ACS基因［10］.
本研究克隆了马铃薯ACS基因cDNA全长序列，并利用生物信息学软件分析ACS基因结构，而且预测了ACS基因编码蛋白的物理性质，为下一步利用基因工程技术，通过正义过表达和RNAi调控ACS合成，进而调控乙烯对马铃薯块茎休眠的生理效应，延长或缩短马铃薯块茎休眠时间奠定了一定基础.
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
马铃薯四倍体栽培品种‘甘农薯2号’试管苗、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α由甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室保存.PMD18－T载体、T4连接酶和 LA Taq DNA 聚合酶、SacⅠ、BamH Ⅰ、XhoⅠ、XbaⅠ等限制
性内切酶均购于TaKaRa公 司；RNA simple Total RNA kit购 自TIANGEN公司；M－MLV逆转录酶、胶回收试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司，引物也由该公司合成.其他试剂均为国产或进口分析纯试剂. 1.2 试验方法
1.2.1 马铃薯叶片总RNA提取与cDNA合成利用植物总RNA提取试剂盒提取马铃薯试管薯叶片总RNA，各步骤均按试剂盒说明书进行.用琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA质量，并选用高质量的RNA进行下游试验.利用M－MLV逆转录酶合成cDNA第1链，具体操作过程参照试剂盒说明书.cDNA保存于－20℃，用于后续试验.
1.2.2 马铃薯ACS基因引物设计及克隆 通过已报道的马铃薯 ACS 基因（序列号为PGSC0003DMT400014932）的序列，利用 Primer 5.0设计PCR引物Ps（上游引物F：GGGATCC（BamH Ⅰ）AAATGGGGTTAATTTCAG；下游引物R：CGAGCTC（SacⅠ）GAACATCACGATTAATTC），由上海生物工程技术服务有限公司合成.其中ACS上下游引物分别添加BamH Ⅰ、SacⅠ酶切位点. PCR反应体系为25μL，10×LA Taq Buffer 2.5μL，dNTP Mixture（2.5mmol／L）4μl，上、下游引物各1μl，模板cDNA 2μL，LA Taq聚合酶0.25μL，ddH2O 14.25μL.反应条件为：94℃预变性3min；94 ℃变性45s，58℃退火1min 30s；72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min.目的产物用琼脂糖凝胶电泳检测，经回收纯化，克隆到PMD18－T载体上，选择阳性克隆，经PCR、酶切验证正确后送上海生物工程技术服务有限公司测序. 1.2.3 基因生物信息学分析 依据ACS核苷酸和氨基酸序列，利用DNAMAN，DNAstar等生物信息学软件进行分析.利用NCBI和DNAMAN完成核算及氨
马铃薯ACS基因克隆及生物信息学分析
