DNA指纹图谱

DNA指纹图谱实验

上课地点：化学楼120 上课时间：选课时

任课教师：薛闯 办公地点：生化楼215 电话：84706308

课程要求：

预习实验内容，掌握实验目的及原理、仪器和试剂、实验步骤；

手写完成预习报告（实验名称、实验目的、实验原理、实验器材与试剂、实验方法与步骤），课堂检查预习报告情况。

自带U盘和尺子。 实验注意事项：

1、实验台上物品按实验室管理老师要求摆放整齐； 2、实验废物按实验室管理老师要求收集； 3、实验结束后，经老师检查后方可离开。 实验纪律： 1、按时上课

2、穿实验服（白大衣）

3、不许吃东西，课堂严禁大声喧哗 4、手机静音 实验成绩：

预习报告： 20分 实验操作： 40分

报告内容：结果和讨论 40分

DNA指纹图谱实验

（指导教师：薛闯）

一．实验目的

1. 掌握 DNA 指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程

2. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定 DNA 片段的长度。

3. 掌握对DNA指纹数据进行基本统计分析方法。 二 . DNA指纹图谱实验原理

1984 年英国莱斯特大学的遗传学家 Jefferys 及其合作者首次将分离的人源小卫星 DNA 用作基因探针，同人体核 DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为 \指纹\，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。由于 DNA 指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。

DNA 指纹具有下述特点：

1. 高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同 DNA 图形的概率仅3×10-11 ；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于 5×10 -19 。全世界人口约 50 亿，即 5×109 。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的 DNA 指纹的图形完全相同。

2. 稳定的遗传性：DNA 是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现， DNA指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递 50 % 给子代。

3. 体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的 DNA 指纹图形完全一致。

DNA 指纹图谱法的基本操作：

从生物样品中提取 DNA （ DNA 一般都有部分的降解），可运用 PCR 技术扩增出高可变位点（如 VNTR 系统，串联重复的小卫星 DNA 等）或者完整的基因组 DNA ，然后将扩增出的 DNA 酶切成 DNA 片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星 DNA 探针与膜上具有互补碱基序列的 DNA 片段杂交，用放射自显影便可获得 DNA 指纹图谱。

DNA 指纹图谱法的基本操作示意图

琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA 在凝胶中的位置。如有必要，

还可以从凝胶中回收DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp 的DNA。长度100kb 或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。

在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。

DNA指纹数据处理：

1. DNA指纹图谱的共有带率（Band-sharing，简称BS）

BS=2NAB/(NA＋NB)

式中：NA指个体A的条带数，NB为个体B的条带数，NAB指个体A和个体B共有的条带数。

2. 平均等位基因频率(q)及最低平均杂合率(Ht)

q ＝l-(1-BS)1/2，Ht＝l-q

式中BS为共有带率。

3. 两个个体具有完全相同的DNA 指纹图谱的概率（P） 两个无关个体具有完全相同的DNA 指纹图谱的概率为：

P1 =（1-2BS＋2BS2 ）n/BS ；

两个同胞个体具有完全相同的DNA 指纹图谱的概率为：

P2 =［1-0.5q（1-q）2（4-q）］n／BS

式中：n 为个体的平均条带数，q 为平均等位基因频率。 三 . 实验材料和试剂

1. DNA 样品：犯罪现场CS DNA 样品、嫌疑犯S1 DNA 样品、嫌疑犯S2 DNA 样品、嫌疑犯 S3 DNA 样品 2. 化学试剂和溶液 (1). TAE（ 50 ×） Tris 242g 冰醋酸 57.1ml

EDTA （ 0.5mol/L pH 8.0 ） 100ml 使用时用蒸馏水稀释 50 倍。 (2).琼脂糖 agarose （电泳级） 3. 仪器设备和消耗品

电泳仪、电泳槽、样品梳、微波炉、移液器（10 μ l）、离心管、一次性枪头，一次性手套。 四 . 实验步骤

DNA样本的琼脂糖凝胶电泳：

1. 用量筒量20ml电泳缓冲液TAE倒入烧杯中，然后用天平称量0.2g琼脂糖倒入烧杯中；

2. 用微波炉加热30秒左右使琼脂糖完全融化（当心煮沸的液体，溢出！）； 3. 冷却至 65 ℃左右时用微量移液器加入10 μl GoldviewTM核酸染料，充分混匀；

4. 将制胶器置于工作台面上，将胶模和梳子分别插入制胶器内，梳子应距胶模一端约1cm，梳齿底边与胶模表面保持0.5-1mm的间隙；

5. 待琼脂糖冷却至60℃左右时，小心倒入胶模内（避免产生气泡），使凝胶缓慢展开直至在胶模表面形成一层约3mm厚的均匀胶层，室温静置30分钟； 6. 待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出梳子（注意切勿使样品槽破裂），在胶模上形成相互隔开的样品槽；

7. 将凝胶连同胶模放入电泳槽平台上，倒入TAE缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm，小心去除样品槽中的气泡；

8. 用微量移液器缓慢地将3μL DNA样品分别加入到样品槽内，注意避免因样品过多而溢出，污染邻近样品；

9. 加样完毕后，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳，在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm（电压值V/电泳槽两极之间距离cm）；

10. 当染料条带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳；关闭电源，然后将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的保鲜膜上，在波长254nm紫外灯下进行观察，DNA条带呈现荧光；在紫外灯下观察 DNA 的迁移位置；