食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定
1 范围
本标准适用于贝类及制品中失忆性贝类毒素的检测。第一法为酶联免疫吸附法，适用于失忆性贝类毒素筛查检测；第二法为高效液相色谱法，适用于贝类可食部分及其制品（不包括盐渍制品）中软骨藻酸的常规检测；第三法为液相色谱-串联质谱法，适用于贝类可食部分及其制品（不包括盐渍制品）中软骨藻酸的确证。
第一法 酶联免疫吸附法
2 原理
本方法测定基础是竞争性酶联免疫反应，酶标板上包被有针对软骨藻酸抗体的捕捉抗体，加入抗软骨藻酸抗体、标准液或样品溶液及软骨藻酸酶标记物，游离的失忆性贝类毒素与软骨藻酸酶标记物竞争软骨藻酸抗体，同时软骨藻酸抗体与捕捉抗体连接。没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质和显色剂加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450 nm测量微孔溶液的吸光度值，样品中的失忆性贝类毒素溶液与吸光度值成反比，按绘制的标准曲线定量计算。 3 试剂和材料
注: 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 3.1 无水甲醇（CH3OH）。 3.2 DA标准物质。 3.3 DA酶标记物。 3.4 抗DA抗体。
3.5 包被有捕捉抗体的微孔板。
3.6 基质（过氧化氢）/发色剂（四甲基联苯胺）。 3.7 洗脱液：0.5％吐温20－PBS。
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3.8 反应终止液: 6 mol/L硫酸。 3.9 半对数坐标纸。
3.10 商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准（附录A）。 4 仪器和设备 4.1 酶标仪：450 nm。 4.2 均质器。
4.3 离心机：转速≥2000 转/分钟。
4.4 微量加样器：50 ?L, 100 ?L，200 ?L,1000 ?L。 4.5 微量多通道加样器：50 ?L～300 ?L。 4.6 天平：感量为0.01 g。 4.7 滤器：0.45 ?m 5 分析步骤 5.1 试样制备 5.1.1 样品采集
5.1.1.1分析样品要有充分的代表性，样品至少要10个以上，尽可能没有个体差异。去壳、带壳或罐装的贝肉，均应采取足够的个数并使贝肉达200 g以上。
5.1.1.2 远离实验室不能及时送检的样品，除了在常温下品质不会发生变化的，应将样品置于保温盒中冷冻送检。如为带壳样品，应按5.1.2的方法开壳，去除水分后冷冻送检。 5.1.2 样品制备
5.1.2.1 生鲜带壳样品的前处理
用清水将贝壳外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用重蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他外来物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，仔细取出贝肉，切勿割破肉体。开壳前不要加热或用麻醉剂。收集100 g贝肉置于筛子中沥水5 min（不要使肉堆积），检出碎壳等杂物，将贝肉均质，备用。 5.1.2.2 冷冻样品的前处理
在室温下，使冷冻样品呈半冷冻状态。带壳冷冻样品，按5.1.2.1方法清洗、开壳、淋洗取肉，此时的贝肉仍呈冷冻状态，除去贝肉外部附着的冰片，轻轻抹去水分；事先已去除水分的冷冻去壳样品，室温缓化。将100 g上述贝肉均质，备用。
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5.1.2.3 贝类罐头
将罐头内容物沥干水分，倒入均质器充分均质，备用 。 5.1.2.4 贝肉干制品
称取100 g干制品放入足量清水中浸泡24 h～48 h（4℃冷藏），沥干、均质、备用。 5.1.2.5 盐渍品
用清水洗涤，流水脱盐, 沥干，均质、备用。 5.2 测定步骤 5.2.1试样提取
称取10.0 g按5.1.2均质的贝类组织（精确至0.01 g），加入10.0 mL水，涡旋振荡1 min, 加入20.0 mL 100％甲醇, 涡旋振荡1 min。3000 g离心10 min,用0.45 ?m滤器过滤上清液，得到样品提取液。用稀释缓冲液将样品提取液稀释100倍（如吸取10 ?L样品与990 ?L稀释缓冲液混合）。取50 ?L按5.2.2方法进行酶联免疫测定。此时的稀释倍数是300。高浓度的样品，如超出标准曲线范围，可进一步用缓冲液稀释，直至样品浓度在标准曲线范围以内。 5.2.2酶联免疫测定
将足够数量的已包被捕捉抗体的微孔条插入微孔架（空白对照、标准液和样液分别做复孔），记录空白对照、标准液和样液的位置。向空白对照孔加入150 ?L稀释缓冲液，向标准液和样液孔分别加入相应的50 ?L 5个～7个失忆性贝类毒素标准液或样液到各自的微孔，每个标准液和样液必须使用新的吸头。向上述所有的微孔中加入100 ?L DA酶标记物工作液，向除空白对照孔之外的所有微孔中加入100 ?LDA抗体工作液，迅速充分混合1 min，用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发，4 ℃孵育2 h。孵育结束后，倒去孔中液体，每个微孔注入300 ?L洗液冲洗，翻转微孔板，倾去孔内液体，再重复以上洗板操作2次，在吸水纸上拍干。每孔加150 ?L底物/显色剂溶液，充分混合，室温避光孵育30 min。每孔加入50 ?L终止液迅速混匀后，在30 min内测量并记录450 nm波长下的吸光度值。 6 分析结果的计算与表述 6.1 计算百分比吸光度值
标准液和样液的平均吸光度值（OD值）减去空白对照孔的平均OD值作为标准液和样液的平均校正OD值。按公式（1）分别求得每个失忆性贝类毒素标准液和样液的百分比吸光度值：
A＝ S-S 1
S0- S1
×100% ……………………… （1）
式中：
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A－百分比吸光度值；
S－失忆性贝类毒素标准液或样液的平均OD值； S1－空白对照孔的平均OD值；
S0－0 ?g/L的失忆性贝类毒素标准液的平均OD值。 6.2 绘制标准曲线
以百分比吸光度值为纵坐标，以失忆性贝类毒素溶液浓度（ng/mL）的对数值为横坐标，绘制标准曲线。每次试验均应重新绘制标准曲线。或通过软件计算出浓度与百分比吸光度值间的标准曲线公式，得到回归方程（2）：
Y＝AlogX+B ………………………（2）
式中：
Y——百分比吸光度值；
X——失忆性贝类毒素浓度，单位为ng/mL。 A和B为根据标准液计算出的公式常数。 6.3 结果的计算
在6.2绘制的标准曲线上读取待测液百分比吸光度值所对应的失忆性贝类毒素浓度，即为待测液中失忆性贝类毒素的含量（ng/mL）。为了获得样品中失忆性贝类毒素的实际浓度（ng/g），从标准曲线上读出的浓度值必须乘以相对应的稀释系数。或通过公式（2）即可求出待测孔的ASP浓度，再乘以样品稀释倍数即为原始样品失忆性贝类毒素浓度。 6.4 结果的表述
当测定值＜20 ?g/g时，则报告失忆性贝类毒素含量＜20 ?g/g。 当测定值≥20 ?g/g时，则报告实际测定数值。 7 其他 7.1 测定低限
方法的测定低限为1 ?g/g。 7.2 回收率
方法的回收率为85%~90%。 7.3 健康和安全
任何失忆性贝类毒素含量值大于20 μg/g的样品即被认为是有害的，对人类食用不安全。
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标准液含有失忆性贝类毒素，应特别小心，避免接触。 甲醇对人体有害，建议有条件的实验室在通风橱中操作。 反应终止液为6 mol/L硫酸，避免接触皮肤。
第二法 高效液相色谱法
8 原理
试样经50%甲醇溶液提取，强阴离子固相萃取柱净化，反相高效液相色谱法测定，外标法定量。 9 试剂和材料
注: 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 9.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 9.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 9.3 乙酸（CH3COOH）：色谱纯。
9.4 乙腈溶液（10%）：量取10 mL乙腈，溶于水并稀释至100 mL。 9.5 甲醇溶液（50%）：量取50 mL甲醇，溶于水并稀释至100 mL。 9.6 甲酸溶液（0.1 mol/L）：量取3.81 mL甲酸，用水稀释至1000 mL。 9.7 乙酸溶液（0.1%）：量取1.0 mL乙酸，用水稀释至1000 mL。 9.8 软骨藻酸标准品（C15H21NO6）：纯度≥90%。
9.9 软骨藻酸贮备液（150 μg/mL）：精确称取适量软骨藻酸标准品，用10%乙腈溶液（9.4）溶解并 定容至软骨藻酸浓度为150 μg/mL。
9.10标准曲线工作液：吸取适量软骨藻酸贮备液，用10%乙腈溶液分别稀释成浓度为0.3 μg/mL、 0.6 μg/mL、3 μg/mL、15 μg/mL、30 μg/mL的标准系列工作液。
9.11强阴离子交换固相萃取柱：3 mL，500 mg，或相当者。用前分别用6 mL甲醇、3 mL水和3 mL50%甲醇溶液(9.5)活化。 9.12滤膜：0.22 μm。 10 仪器和设备
10.1 高效液相色谱仪：配有二极管阵列或紫外检测器。 10.2 分析天平：感量为0.1 mg和0.01 g。 10.3 组织均质器：转速≤20000 转/分钟。 10.4 涡旋振荡器。
10.5 离心机：转速≥8000 转/分钟。
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贝类中失忆性贝类毒素的测定 标准文本(食品安全国家标准)
