提取方法2：
Zhang CF, Peng SB, Peng XX, Chavez AQ,Bennett J. Response of glutamine synthetase isoforms to nitrogen sources in rice Oryza Sativa.L roots.Plant Sci,1997,125:163-170
Rhodes D, Rendo GA, Stewart GR. The control of glutamine synthetase level in Lemna minor L. Planta, 1975, 125:201-211
The reaction mixture (3.0 ml) consisted
of sodium ketoglutarate (10_mol), ammonium chloride (10_mol), calcium chloride (10_mol), NADH (2_mol), Tris–HCl buffer (100_mol, pH 8.2) and enzyme 0.1 ml.
Following a 30 min incubation period at 30?C in 20μmol MgSO4, 80μmol α-ketoglutarate, 6μmol hydroxylamine, 8μmol ATP and enzyme extract, the enzymatic reaction was terminated by the addition of 1.5 ml of a solution containing 0.37mol/l FeCl3, 0.2 mol/l TCA and 0.37 mol/l HCl and the amount of glutamyl hydroxamate determined at 540 nm.
Lea P J, Blackwell R D, Chen F L. Enzymes of primary metabolism. In: Harborne J B. Methods in Plant Biochemistry. Vol.3. New York: Academic Press, 1990. pp 260-273
the reaction mixture (3 ml) consisted of 5μmol α-ketoglutarate, 1μmol potassium chloride, 48.75μmol Tris–HCl buffer (pH 7.6), 0.6μmol NADH, 0.3 ml enzyme and 8μmol L-glutamine
300μmol Tris–HCl buffer (pH 8.0), 600μmol ammonium chloride, 3μmol calcium chloride, 0.6μmol NADH, and 0.1 ml enzyme. The change of absorption value was detected at 340 nm in 3 min,
Singh RD, Srivastava H S. Increase in glutamate synthase (NADH) activity in maize seedlings in response to nitrate and ammonium nitrogen. Physiol. Plant, 1986, 66:413-416
Loulakakis KA, Roubelakis-Angelakis KA. Intracellular localization and properties of NADH–glutamate dehydrogenase form Vitis vinifera L.: Purification and characterization of the major leaf isoenzyme. Journal of Experimental Botany, 1990, 41:1223-1230
EP酶活性的测定
高玲, 叶茂炳‘ 张荣铣“ 徐朗莱, 小麦旗叶老化期间的内肤酶植物生理学报,1998,24（2）183-188
硝酸还原酶活性的测定：
仪器：离心机；分光光度计；冰箱；研钵；试管等
试剂：亚硝酸钠；Na2HPO4·12H2O；NaH2PO4·2H2O；磺胺；浓盐酸；萘基乙烯胺；KNO3；K2HPO4·3H2O；半胱氨酸；EDTA；NADH（辅酶Ⅰ）
李合生主编，植物生理生化实验原理和技术，高等教育出版社，2000,125-127 Li H-S(李合生). Experimental Principle and Technique for Plant Physiology and Biochemistry (植物生理生化实验原理和技术).Beijing: Higher Education Press, 2000. pp 125-127 (in Chinese)
关于您问的“磷酸缓冲液里该加多少EDTA和半胱氨酸，均没有说明”
在此书的P126页写的很全面，步骤也非常详细，请查阅， 如：提取缓冲液。0.1211g半胱氨酸、0.0372g EDTA 溶于100ml0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲液中。 另外我们做此实验用的去离子水。
孙老师：您好！
首先非常感谢您的帮助！
前一段时间认真的研究了您给我发的关于氮代谢关键酶测定的方法。其中尚有一些不太明白的地方，恳请您给予解读。
1、您给我了两种GS合成酶活性的测定方法，是不是这两种方法都可以测定？ 2、方法一（Lea，1990）相对简单，但不知“γ-谷氨酰基异羟肟酸”的标准曲线如何制作？ 再次感谢您的帮助。 祝好 罗宏海
罗老师：
您好！这几天我有事没有及时看邮件，关于您提出的问题现解释一下，方法1和方法2我军做过比较试验，结果有一点差异，只要你选择一种方法即可，此外只是方法1做实验过程中可以组合配成混合液，原理一样的，即谷氨酰胺转化为 γ—谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在 540nm 处有最大吸收峰，以此制作标准曲线，但不同作物标样的量不同，只是在实验处理前把酶液改加呈不同梯度的标液，其他均不变，总显色体积也一致即可。 祝顺利。
孙永健 2011年6月24日
GS,GOGAT,GDH等酶活性测定最终版
