HPLC-ELSD法分析注射用硫普罗宁含量及有关物质

HPLC-ELSD法分析注射用硫普罗宁含量及有关物质

陈来景，郭庭莉，刘鸿敏，张冬云

（河南省新谊药业股份有限公司，河南 新乡453731）

[摘要] 目的：建立注射用硫普罗宁含量及有关物质高效液相色谱—蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）检测方法。方法：采用Kromasil C18（250mm ×4.6mm，5μm）色谱柱；柱温30℃；甲醇—0.5%醋酸溶液 （20：80）为流动相；流速0.8 ml·min-1；蒸发光散射检测器漂移管温度44℃，载气2.4Bar，撞击器开。结果：进样量在5.24μg～25.55μg范围内与峰面积的对数呈良好线性关系（r=0.9994），重复性试验RSD为1.08%，检测限和定量限分别为0.2μg和0.5μg。结论：方法快速、简便，结果准确可靠，重复性好。

[关键词] 注射用硫普罗宁；含量；有关物质；高效液相色谱法；蒸发光散射检测器 中图分类号：R917 文献标识码：A

HPLC-ELSD Analysis of Tiopronin for Injection and Its Related Substances

Chen Lai-jing，GUO Ting-li，Liu Hong-min，Zhang Dong-yun (Henan Xin-Yi Pharmaceutical Co., Ltd.,Xinxiang Henan 453731)

[Abstract] Objective: To develop an HPLC-ELSD method for the determination of Tiopronin for Injection and its related substances method . Methods: The column:Kromasil C18 (250mm × 4.6mm, 5 μ m).The column temperature: 30 ℃.The mobile phase: methanol -0.5% acetic acid (20:80).Flow rate: 0.8 ml·min-1. The Drift tube temperature: 44 ℃. Gas Operation Pressure: 2.4 Bar.Impactor on . Results:The calibration curve was linear in the rang of 5.24μg ~25.55μg(r=0.9994). The repeatability(RSD) was 1.08%. The limit of detection and quantification were 0.2 μ g and 0.5μ g respectively. Conclusion: The method is simple and rapid,the results are accurate and reproducible. [Key words] Tiopronin for Injection; Content Determination; related substances; HPLC; ELSD

硫普罗宁（Tiopronin），化学名N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸，首先在日本上市，而后德、意、美、瑞士等国家相继作为改善肝功能药物应用于临床。自注射用硫普罗宁由新谊药业股份有限公司在国内首家上市后，目前已有近十年的生产及临床应用历史。

注射用硫普罗宁现行标准[1]中没有建立注射用硫普罗宁有关物质检验项目，笔者经过研究，建立了注射用硫普罗宁含量及有关物质HPLC-ELSD测定方法，该方法能有效避免硫普罗宁现行标准中TLC法及文献中HPLC-UV法进行硫普罗宁质量控制的缺陷，且快速、简便，结果准确、可靠，重复性好，现报告如下： 一、材料与试剂

Agilent 1100型液相色谱仪；Alltech ELSD2000+蒸发光散射检测器；浙江大学N2010色谱工作站；Kromasil C18（250mm ×4.6mm，5μm）色谱柱。注射用硫普罗宁（河南省新谊药业股份有限公司）；硫普罗宁对照品（河南省联谊制药有限公司）；右旋糖酐40（许昌双马万通制药有限公司）；甲醇、冰醋酸为色谱纯。 二、实验方法 1色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（250mm ×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇：0.5%醋酸溶液 （20：80）；流速：0.8 ml·min-1；柱温：30℃；进样量：10μl；蒸发光散射检测器漂移管温度44℃，载气2.4Bar，撞击器开。 2样品溶液制备方法

取注射用硫普罗宁分别加入双氧水、浓氨水、冰醋酸、及纯化水，进行相应的氧化、碱水解、酸水解、80℃升温破坏试验，之后以流动相将破坏后样品溶解，制备成相应的破坏试验考察溶液；另取硫普罗宁、右旋糖酐40，分别以流动相溶解，制备成原辅料对照溶液。 三、实验结果：

3.1专属性 所采用方法能对样品中各成份进行有效分离，结果详见图1～图7。

1

3.2线性范围 精密称取硫普罗宁适量，以流动相溶解定容，制成浓度分别为0.524g·L-1、0.822 g·L-1、1.079 g·L-1、1.286 g·L-1、1.561 g·L-1、2.016 g·L-1、2.555 g·L-1的硫普罗宁溶液，在上述色谱条件下进行测定，记录色谱图，以进样量（M）与样品出峰面积（A）的自然对数进行线性回归计算,回归方程lnA=1.4381lnM +9.8287，相关系数r=0.9994，（n=7）。在5.24μg～25.55μg范围内，线性关系良好。

3.3 精密度 制备0.1mg/ml、1.0 mg/ml、10.0 mg/ml的样品溶液，在上述色谱条件下以10μl各重复进样6次，测定峰面积，RSD分别为1.45%、0.46%、0.19%。

3.4 重复性 按含量测定方法，取样品分别制备6份样品溶液，测定峰面积并计算含量，RSD为1.08%。

3.5 回收率 分别精密称取8mg、10mg、12mg硫普罗宁对照品加入处方量右旋糖酐40，每个浓度制备3份，按含量测定方法进行试验，回收率符合要求，结果见表1。

3.6 溶液稳定性 取同一对照品溶液在室温下放置，分别在0，1，5，8，9，10h取样测定，RSD为1.8%,结果表明，10h溶液稳定。

3.7 检测限、定量限 取对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，检测限为0.2μg，定量限为0.5μg。

3.8 含量测定 取硫普罗宁对照品适量，精密称定，分别用流动相溶解并定量制成每1ml中含硫普罗宁0.8mg、1.0mg、1.2mg的溶液，摇匀，作为标准品溶液（1）、（2）、（3）。精密量取上述三种溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以标准品溶液进样量的对数值与相应的峰面积对数值计算回归方程，相关系数（r）应不小于0.99；另取注射用硫普罗宁适量，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含硫普罗宁1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液，同法测定，用回归方程计算硫普罗宁含量，080101-1、080102-1、080103-1三批样品含量测定结果分别为100.6％、101.5%、102.1%，RSD％（n=2）分别为0.88%、1.35%、0.53%。 3.9 有关物质测定 取注射用硫普罗宁一支，加流动相溶解并稀释至10ml（含硫普罗宁约为10mg/ml）,作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；称取右旋糖酐40适量，以流动相溶解制成5mg/ml的空白辅料对照溶液。照含量测定项下色谱条件，精密量取上述供试品溶液、对照品溶液及空白辅料对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。扣除空白辅料峰，供试品溶液中如有杂质峰，所有杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。080101-1、080102-1、080103-1三批样品杂质峰面积之和分别为2175、5563、3345，对照溶液主峰面积分别为13594、13491、14009，均符合规定。 四、 讨论

4.1注射用硫普罗宁国家药品标准[1]中,含量测定采用的是碘量法,对注射用硫普罗宁药液进行高温加速破坏，以碘量法测定含量，测定结果出现了小幅度上升，而用本文建立的HPLC-ELSD分析方法进行测定，则显示样品溶液中硫普罗宁含量呈下降趋势，且破坏产物量逐渐增加，因而认为现行国家标准中含量方法专属性不强。

4.2高效液相检测器的选择：目前对于硫普罗宁原料、制剂含量及有关物质研究，多采用HPLC-UV法[2][3]，由于硫普罗宁为紫外末端吸收，方法中流动相的pH值较低、水的比例较高，色谱条件较为苛刻，且紫外检测器对于无紫外吸收的杂质不能检出，结构不同的物质在紫外条件下的响应值不同，分析中的受限因素较多。在无有关物质对照品情况下，采用主成份自身对照法进行有关物质检查，检验结果的准确性亦受到一定的影响。

本文采用的蒸发光散射检测器是一种通用型检测器，其响应值几乎仅与待测物的质量有关[4]，它不依赖于样品的光学特性，可以检测任何挥发性低于流动相的化合物，对于注射用硫普罗宁而言，不仅可以进行主成份的质量控制，对辅料亦有较好的检出性能，且本文所建立的HPLC-ELSD分析方法，方法简便，易于操作，使用不同品牌色谱柱进行试验，检验结果的重现性良好，因而认为此种方法更适用于硫普罗宁含量及有关物质分析。

4.3蒸发光散射检测器条件的选择：曾采用蒸发光散射检测器撞击器关的模式进行方法研究，该模式下，需要的漂移管温度较高，且样品的检出范围窄，不适合用于注射用硫普罗宁含量及有关的测定。

4.4样品溶液配制用溶剂的选择：分别尝试将样品用甲醇、流动相、水溶解后进行测定，试验

2

结果表明，溶剂不同，同一浓度条件下，样品的响应值、出峰状况均不相同，经过综合评定，以流动相作为样品配制用溶剂的方法为最好。 五、结论：

综上所述，笔者认为本文所建立的HPLC-ELSD法分析注射用硫普罗宁含量及有关物质，方法可行，可以用于注射用硫普罗宁的质量监控。

参考文献：

[1] WS1-(X-001)-2005Z,Tiopronin for Injection(注射用硫普罗宁)[S].

[2]ZHOU Z M,HE L Y.Determination of the dissolution of Tiopronin tablet by HPLC[J].Practical Pharmacy And Clinical Remedies (实用药物与临床),2007,Vol.10,No.3:190-191.

[3]WANG L P,LIU H L,WU Q.Determination of Tiopronin Injection by HPLC[J].Drug Standards of China (中国药品标准),2008,vol.9,No.1:71-73.

[4]Ch.P(2005) Vol Ⅱ(中国药典2005年版.二部)[S].2005:Appendix V D 表1 回收率试验结果 Tab.1 The results of Recovery True vale/mg

7.96 8.12 8.14 10.19 10.35 10.15 11.96 12.42 12.67

Measured vale/mg

8.13 8.31 8.33 10.38 10.48 10.44 11.97 12.54 12.77

Recovery/% 102.14 102.34 102.33 101.86 101.26 102.86 100.08 100.97 100.79

The average recovery/%

101.63

RSD/% 0.89

10095908580757065[mV]605550454035302520151001234567硫普罗宁6475A=6793105[min] 图1硫普罗宁 Fig. 1 Tiopronin

4442403836343246[mV]302824222018161412012右旋糖酐22598A=572426右旋糖酐402024A=22687345678910[min] 1112图2 右旋糖酐40 Fig. 2 Dextran 40 硫普罗宁 6.418 A=295333125120115110105100959085807570656055504540353025201501234567[mV] 右旋糖酐40 1.968 A=61411401351308 91011121314151617181920[min] 3

图3 注射用硫普罗宁 Fig.3 Injection tiopronin

16375115=70 A52.065 204酐70160糖2旋822=9355右 A06 7827=502. A 1763892]8物V4553.m8产 1=4[1坏8 A物4020破096产9=化25.46= A 6坏氧359 A726宁破 =3 A3.3罗化303.4 5 32普氧0.61分硫 2物组 252酐产坏糖环破20旋破化右化氧氧 15 1001234567891011121314151617[min] 图4 双氧水破坏

Fig. 4 Hydrogen peroxide damage

3150832114021=6 A130092329.34120 6= A宁0罗1110.0普 2硫01004 酐糖90旋右]5V80 5m0[67=7007 A6847160=.9 A 202550分.7 2组1坏40分破组碱30坏 破碱20 1001234567891011121314[min] 图5 氨水解

Fig. 5 The ammonia water hydrolysis

5821033520041=190A8918036170宁1601罗66普15064硫5140=A0130101202]0V4m110酐[100糖旋90右508093=70A160362502酐40糖30旋右201001234567891011121314[min] 15图6 冰醋酸水解

Fig. 6 The acetic acid glacial hydrolysis

9919093218031=170 A61.4160 6宁15050罗21402普25硫=130 A 01202.0 29110054]7V酐6m4[100糖=旋 A9099右951345.1380 384 3=093 A3=3157034= A=9 A7 A物54产2.608.81 10.0环 2.6 331破50 22物2分分化产40酐组组氧糖坏坏坏 破30旋破破右碱化20碱氧 1001234567891011121314[min] 15图7 80℃ ,4小时 Fig. 7 80 ℃, 4hrs

4

1617