Hans Journal of Food and Nutrition Science 食品与营养科学, 2024, 9(3), 236-243 Published Online August 2024 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/hjfns https://doi.org/10.12677/hjfns.2024.93031
Study on the Extraction Technology of Components from Synnemata of Isaria cicadae by Ultra-High Pressure
Wei Wang1,2, Ming Cheng2, Weihong Zhang2, Yiqian Zhou2, Shijun Yu2
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Administration for Quality and Safety of Agricultural Products in Xuancheng, Xuancheng Anhui School of Biology and Food Engineering, Chuzhou University, Chuzhou Anhui
ththst
Received: Jul. 12, 2024; accepted: Jul. 24, 2024; published: Jul. 31, 2024
Abstract
In this work, the extraction rate of adenosine was used as the index to optimize the extraction technology of synnemata of I. cicadae by ultra-high pressure using single factor experiments and orthogonal experiment. The results showed that: the pressure 350 MPa, time 15 min, materi-al-liquid ratio 1:40 (g/mL), and ethanol 20% were the optimal extraction conditions. Under this condition, the extraction yield of adenosine could reach (1.80 ± 0.17) mg/g, the extraction yields of ergosterol, mannitol, soluble protein and free amino acids were significantly higher than that of without ultra-high pressure treatment. And the ultraviolet absorption peak solution around 250 - 280 nm and the fluorescence peak intensity between 280 - 300 nm and 350 - 400 nm of the ul-tra-high pressure extraction were significantly higher than those of without ultra-high pressure extraction. Ultra-high pressure technology could effectively promote the dissolution of nutrients and functional components synnemata of I. cicadae.
Keywords
Ultra-High Pressure, Isaria cicadae, Adenosine, Extraction Technology
超高压提取蝉花孢梗束成分工艺的研究
王 伟1,2，程 铭2，章苇虹2，周怡倩2，于士军2
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收稿日期：2024年7月12日；录用日期：2024年7月24日；发布日期：2024年7月31日
文章引用: 王伟, 程铭, 章苇虹, 周怡倩, 于士军. 超高压提取蝉花孢梗束成分工艺的研究[J]. 食品与营养科学, 2024, 9(3): 236-243. DOI: 10.12677/hjfns.2024.93031
宣城市农产品质量安全监管局，安徽 宣城 滁州学院生物与食品工程学院，安徽 滁州
王伟 等
摘 要
本文以腺苷的提取得率为指标通过单因素实验和正交实验法优化了超高压提取蝉花孢梗束中成分的工艺。结果表明：压力强度为350 MPa、保压时间为15 min、料液比为1:40 (g/mL)、溶剂为20%的乙醇是最佳工艺条件，在此条件下腺苷的提取量可达(1.80 ± 0.17) mg/g，麦角固醇、甘露醇、可溶性蛋白和游离氨基酸的提取得率显著高于未经超高压处理(P < 0.05)。超高压提取液在250~280 nm附近紫外吸收峰和在280~300 nm及350~400 nm之间的荧光峰强度明显高于未经超高压提取的。超高压技术能有效促进蝉花孢梗束中的营养和功能成分溶出。
关键词
超高压，蝉花孢梗束，腺苷，提取工艺
Copyright ? 2024 by author(s) and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Open Access 1. 引言
蝉花是由蝉棒束孢寄生在蝉若虫体内并利用寄主体内的营养物质，在适宜的环境中生长形成的虫菌复合体[1]。蝉花又名蝉菌、蝉蛹草、胡蝉等。蝉花在微生物分类学中属于虫草科棒束孢属。蝉花富含多糖、甘露醇、虫草酸、蛋白质、麦角固醇、多种微量元素等有效成分，与冬虫夏草一样同属于虫菌复合体。温鲁等学者将蝉花孢梗束与蛹虫草和冬虫夏草进行了比较，测定结果表明蝉花孢梗束是一种优质虫草，具有很大的研究前景[2] [3]。
蝉花孢梗束作为药用真菌的使用已有多年的历史了，具有多方面的药用价值。Fujita等从蝉花孢梗束中分离得到的ISP-1，具有显著的免疫抑制性[4]。现代医学也对蝉花孢梗束进行了研究，研究表明蝉花孢梗束具有调节免疫功能、散热镇静、调节肾功能等作用[5]。
超高压提取技术的原理是在高压力的推动下一方面可以将提取剂迅速地渗透到细胞内部，另一方面在升压和卸压的过程中压力的骤变对细胞造成强烈的冲击致使其发生裂解，使细胞内部的有效成分随着溶剂快速地流到细胞外[6]。超高压技术已广泛应用于提取工艺的研究中，并证实该技术不仅操作简单而且提取率高，超高压技术提取可以有效避免有效物质因热效应而导致生理活性的降低甚至是分解[7]。
目前，日本在超高压技术这方面的研究位居领先的水平[8]。在我国，胡小松等利用超高压技术研究其对果蔬汁的杀菌效果、果蔬感官及品质、果蔬汁黏度及颜色、嗜热链球菌活性等[9] [10] [11]。也有人研究了超高压对鲈鱼、茶叶等挥发性成分多方面的影响[12] [13]。
此项研究利用超高压技术处理蝉花孢梗束，研究蝉花孢梗束超高压处理的最佳工艺，以期为今后的蝉花孢梗束加工及其他制品的超高压工艺提供理论上的支持。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料与仪器
2.1.1. 材料和试剂
蝉花孢梗束粉：购于浙江泛亚生物医药股份有限公司；真空包装袋：购于兴隆包装。
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乙醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)、冰醋酸(分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司)、盐酸(分析纯，上海振企化学试剂有限公司)、磷酸二氢钾(分析纯，天津博迪化工股份有限公司)、考马斯亮蓝G250 (85%，国药集团化学试剂有限公司)、乙酸铵、高碘酸钠、磷酸、乙酰丙酮(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)、甲醇、乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)。 2.1.2. 仪器与设备
S-433D全自动氨基酸分析仪(德国赛卡姆)，FA2204B电子分析天平(上海越平科学仪器有限公司)，JP-400B小型高速粉碎机(浙江永康市久品工贸有限公司)，DP-01真空泵(天津市东康科技有限公司)，DHG-9070B电热恒温鼓风干燥箱(上海中贤恒温设备厂)，1260高效液相色谱仪(安捷伦仪器有限公司)，T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，超高压仪(天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司)，超声波仪(金坛市文华科教实验仪器厂。
2.2. 实验方法
2.2.1. 蝉花孢梗束的核苷提取工艺
1) 工艺流程
蝉花孢梗束粉末→加溶剂混匀→超声波处理30 min→真空包装(5 mL/包)→超高压提取→离心→取上清液→检测
2) 操作要点
将精确称量的蝉花孢梗束粉末和水按比例装在真空包装袋中。在30℃、300 W条件下超声波提取30 min，超声处理时一样要将包装袋完全浸没在水中。真空包装采用的条件为真空30 s，封口3 s，冷却3 s，使用封口机封口后充分混匀。每个样品需要进行高效液相色谱仪的样品都要经0.45 μm微孔滤膜过滤。 2.2.2. 实验设计
1) 单因素实验
影响超高压对蝉花孢梗束成分的溶出有很多因素。如压力强度、保压时间、蝉花孢梗束的料液比以及溶剂等。在进行正交实验之前，应先通过单因素实验来选取合适的因素和水平。分别以不同的压力、保压时间、料液比以及溶剂做单因素实验，并以腺苷的提取量为指标，考察各单因素对腺苷的影响。
① 压力强度
设定保压时间为15 min、蝉花孢梗束料液比为1:20 (m:V)、提取剂为50%的乙醇的条件下：考察在(0、100 MPa、200 MPa、300 MPa、400 MPa、500 MPa)的压力梯度下对蝉花孢梗束中的腺苷含量的影响。
② 保压时间
设定为最佳压力、蝉花孢梗束料液比为1:20 (m:V)、提取剂为50%的乙醇的条件下：考察(0、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min)的保压时间的梯度下对蝉花孢梗束中的腺苷的影响。
③ 料液比
设定为最佳压力和保压时间、提取剂为50%的乙醇的条件下：考察不同在(1:10、1:50、1:100、1:150、1:200，m:V)的蝉花孢梗束料液比梯度下对蝉花孢梗束中的腺苷含量的影响。
④ 溶剂
设定为最佳压力和保压时间、蝉花孢梗束料液比的条件下：考察不同乙醇浓度的溶剂(0、25%、50%、75%、100%)对蝉花孢梗束中的腺苷含量的影响。
2) 正交实验
根据单因素实验的结果，选取最佳料液比、压力强度、保压时间以及溶剂的水平，详见表1，采用L9(34)进行正交实验。按照“2.2.1”的方法处理并检测。
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Table 1. Factor levels of orthogonal experimental design 表1. 正交实验因素水平表
水平 1 2 3
A压力(MPa)
350 400 450
B保压时间(min)
15 20 25
C料液比(g/mL)
140 1:50 1:60
D溶剂(%)
20 25 30
将正交实验结果进行分析总结得到最优方案后再进行3组验证实验，通过与上述单因素实验和正交实验得到的结果进行对比。验证实验组所得到的数据结果与上述正交实验的得到的数据进行对比，若没有显著性差异，说明上述实验可靠，就能进一步确定提取过程中的最佳工艺条件。
2.3. 测定方法
2.3.1. 腺苷含量的测定
腺苷含量参考牛聪聪等人的方法进行测定[14] [15]。 2.3.2. 甘露醇的测定
甘露醇含量参考李颜等人方法的比色法进行检测[16]。 2.3.3. 麦角固醇的测定
麦角固醇含量的测定参考孙佰申等的方法[17]。 2.3.4. 可溶性蛋白质的测定
可溶性蛋白质含量参考黄婉玉等人的方法测定[18]。 2.3.5. 游离氨基酸的测定
游离氨基酸的测定参考姜荷等人的方法测定[19]。 2.3.6. 荧光光谱的扫描
采用李双芳的荧光扫描方法，利用荧光分光光度计，对样品进行扫描[20]。 2.3.7. 紫外光谱的扫描
用紫外分光光度计进行200~400 nm之间的全波段扫描。
2.4. 数据处理与统计分析
采用SPSS 19.0软件进行显著性分析，采用Duncan新复极差法对不同实验组间数据进行差异显著性比较分析，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01
表示差异极显著。
3. 结果与分析
3.1. 单因素实验
蝉花孢梗束经不同压力强度处理后，腺苷提取量在0~400 MPa随压力强度的升高而上升，但在500 MPa时有明显的下降趋势，如图1(A)所示。根据Le Chatelier原理，当压力强度增大时，体系的平衡总是向着减少压强的方向移动，这样便有利于乙醇进入到细胞的内部与腺苷物质结合，逐渐使这种结合达到平衡状态[21] [22]。由于在升压和卸压的变化过程中，细胞容易破裂，从而扩大了乙醇与腺苷物质的接
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触面积，使有效成分更迅速的与溶剂结合，减少了提取的时间。从图1上可以看出当压力强度为400 MPa时，腺苷提取量最高，且于附近两个水平的差异较大，所以正交实验压力强度设定范围在300 MPa到450 MPa之间。
从图1(B)可知，随着保压时间的延长，蝉花孢梗束中的腺苷提取率先是有显著增加；但超过15 min后，腺苷浸出量增加趋于平缓可能是因为腺苷溶出已经达到平衡状态，再延迟时间腺苷含量也很难再增加。故后续实验中考虑到提取的成本，最佳保压时间定在15 min，而正交实验中保压时间设定在15 min到20 min之间。
不同料液比下所测得的样品中腺苷提取量，结果见图1(C)。随着溶剂量的不断增大，腺苷浸出量也不断增加。当乙醇与蝉花孢梗束粉末的比值增大时，乙醇与有效成分接触的机会就会增多。当达到饱和状态之前，腺苷浸出量不断增加的。但当料液比过大时腺苷的提取量呈现出下降趋势，料液比为1/50腺苷的提取量最高。正交实验时选择料液比的水平范围在1:40和1:60 (g/mL)之间。
不同浓度的乙醇溶液所提取的样品中的腺苷提取量，结果见图1(D)。由图可以看出，腺苷的提取量呈现出先增加后减少的变化趋势，25%乙醇腺苷提取量高于其他乙醇浓度。故选25%乙醇最佳水平，正交实验的设定范围为20%~30%乙醇溶液。
Figure 1. Effects of different factors on the extraction rates of adenosine 图1. 不同因素对腺苷提取量的影响
3.2. 正交实验分析
在单因素实验的基础上，确定蝉花孢梗束中腺苷提取工艺的压力强度、保压时间、料液比、溶剂的最佳水平范围。采用L9(34)设计实验，样品按照“2.2.1”处理；用高效液相色谱仪测定腺苷提取量，结果如表2。
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