第38卷第3期2802009年5月 卫生研究
JO U R N A L O F H Y G I E N E R ES EA R C H V01.38N o.3 M ay2009
文章编号:1000-8020(200903.02∞.04
几种生物活性物质体外抗氧化能力评价技术的研究 刘小兵朴建华1田园
中国疾病预防控制中心营养与食品安全所,北京100050 论著
摘要:目的研究生物活性物质体外抗氧化能力评价方法,应用体外理化环境下建立起来的评价方法对受试物进行初步抗氧化能力评估。方法联合应用2,2’.连氮.双.(3.乙基苯并噻唑.6.磺酸二铵盐(AB T S
法与铁离子还原/抗氧化能力测定法(r aA P法用于生物活性物质体外抗氧化能力研究。在A B T S法中。使用
紫外可见分光光度计734nm波长下测定以槲皮素、姜黄素、D L-a.生育酚和原花青素等为代表的生物活性物
质;在FR A P法中,运用酶标仪,595nm波长处测定同样受试物的抗氧化能力。结果A B TS法:槲皮素和姜黄
素的抗氧化活性T E A C值分别约为2.02和0.50;而l g D L-a.生育酚、原花青素清除自由基的能力相当于
2.06m m ol、2.897m m ol的Trol ox清除自由基的能力;F RA P法:抗氧化活性以1.O m m ol/L FeS04为参考标准,槲皮
素、姜黄素和Tr ol ox摩尔当量约为5.73、1.18和2.09;而D L-a.生育酚和原花青素抗氧化活性分别是207.7m g、
156.36r ag。结论A B TS法与FR A P法联合应用,操作简便、结果可靠,尤其适宜作为生物活性物质体外抗氧
化能力的评价方法。
关键词:生物活性物质氧化应激中图分类号:R151.2Q591A B T S法FR A P法抗氧化能力
文献标识码:A
R ese a r ch on t he eval uat i on m et hods f or ant i oxi dant capaci t y of s ever al bi oact i ve s ubs t ances/n vi t r o LI U X i aobi ng,P I A O Ji anhua,TI A N Y ua n
I nst i t ut e of N u t r i ti on a nd F oo d Saf et y,C hi nes e C ent er f or D i seas e C ont r ol a nd Pr event i on,B eij i ng100050,C h i na
A bst r act:O bj ect t ve T o s t udy t he eval u at i on m e t h ods f or ant ioxi dant capaci t y of bioacti ve s ubs t
B nce i n础阳,an d t O appl y t he m e t h ods w h i ch i s es t abl i s hed i n physi eochem i ea l envi r onm ent i n or der t o g i v e t he pr eli m i nar y as se韶,m ent of t e st subj e ct s.M et hods7r he co m bi ne d appli cat i on of A B T S and F R A P m e t h ods i n t he as s es s m ent s.us i ng t he U V—V I S
s pect r ophot om e t er a nd t he aut oau al yzer r es pecti vel y t e at t he ant ioxi dant capaci t y of quer cet i n,cur cum i n,D L-a-t ocop her ol and pr ocyani di ne at734砌i n A B T S and at595nm i n F RA P.R es ul t s A B'I S:n地TEA C value8of quer cet i n and eur cu m i n w e r e abou t2.02and0.50.19D L-a-t oeopher o l and an t hoc yani m w er e equi val ent t o2.06m m01.2.897m m ol of Tr o l ox i n s caven gi ng
fr e e r adi cals ca pa ci t y.nu憎:U se d1.O m m ol/L FeS04粕t he r ef er ence st and ar d,qu er cet i n,eur cum i n and Tr olox equi v al ent m o l ar about5.73,1.18a nd2.09.D L-a-t ocopher o l,ant i oxi dan t a ct i vi t y of pm an t hocyani di ns w e m 207.7m g and156.36r ag.C oncl us i on I t W a S s uppor t e d s upp or t t ha t co m bi ne d A B T S and F R A P m et hods.becau se of t hei r conv eni ent l y,and t h ei r r el ia ble r es u l t s,es peci al l y i n appr o pr i at el y be us ed a s t he eval uat ion m e t h ods for an t i ox i dan t capaci t y of bi oact i ve s ubst ance讯v/l r o.
K e y w ords:li i oact i ve f act or s,oxidat ive st r ess,A B TS,FR A P,ant i oxi dant eapaci t y
人类和动物持续暴露在活性氧与促氧化剂中,很容易引起机体组织发生氧化应激,导致机体的代谢性功能紊乱以及一系列的慢性疾病,如:癌症、血脂异常等…。大量的流行病学与临床研究显示。人群在消费富含天然生物活性物质的蔬菜和水果后,其所患有心血管疾病、糖尿病、癌症等非传染性疾病的风险将明显降低乜J】。因此,食用一些富含具有抗氧化生物活性物质的功能性食品,以延缓或预防机体组织氧化应
基金项目:国家科技支撑计划项目(N o.2006BA D27801 作者简介:刘小兵,男,硕士研究生
1通讯作者:朴建华,男。研究员激损伤的这种做法,已经得到了消费者和科学家们的广泛认同H J】。然而,面对如此众多的生物活性物质,如何才能准确、快速地做出辨别,这个问题已经摆在了科学家面前。最近20年,筛选评价生物活性物质抗氧
化活性的方法层出不穷,尤其是体外筛选评价方法,尽管其问还存在着由体外到体内研究的可行性争议,但是围绕着如何更好的筛选评价生物活性物质体外抗氧化能力的诸多方法均已得到了很好的建立与长足的发展。
在目前,体外抗氧化能力评价实验中,生物源性的红细胞氧化溶血实验与低密度脂蛋白(LD L氧化实验等均被认为是研究自由基诱使细胞膜损伤与评价植物多酚类物质抗氧化能
第3期刘小兵,等.几种生物活性物质体外抗氧化能力评价技术的研究28l 力的良好模型№]。同时,许多理化环境下建立起来的评价方法也越来越受到重视,已经建立起的方法。如:2,2’.连氮.双.
(3.乙基苯并噻唑.6.磺酸二铵盐法[2,2-azi nobi s-(3. ethyl b enzo t hiazoli ne-6-sul f o ni c aci d一di am m oni um s al t,A BTS]、l,1.二苯代苦基苯肼法[2,2-di phenyl.1.pi cr yl hydr azyl,D PPH]、铁离子还原/抗氧化能力测定法[Fer r i c r educi ng anti oxidant po w er, FB A P]、氧自由基吸收能力测定法[O xygen r adi ca l absor pt ion capaci t y,O R A C]、化学发光法[P hot oehem i hm i nes cence as sa y, PLC]等;这些方法特别适合进行大量生物活性物质体外抗氧化能力的快速筛选。但是,由于每种评价方法本身存在的缺陷,仅仅单独使用~种方法难以得出令人信服的结论。因此,本实验在总结众多文献结论的基础上,决定采用两种基于不同原理的体外抗氧化能力评价方法对槲皮素、姜黄素、D L廿生育酚和原花青索等几种生物活性物质进行体外抗氧化能力评价,应用的评价方法为A B TS法和FR A P法。
l材料与方法 1.1材料
A B幅[2,2.azi nobi s-(3-et hylbenzot hi azol ine.6.sul f oni c aci d-di am m on i u m sal t](Si gm a-A l dr i ch公司;Tr ol ox[6-hydr oxy一2,5,7, 8-t et ram ethyl chr om an-2-car boxyl i c ac i d](S i gm a.A l dr i c h公司;唧[2,4,6-tripyridyl.s-triazine](Sigma-Aldr ich公司;DL广口.生
育酚(Al fa A e sa r公司;过硫酸钾、硫酸亚铁、冰醋酸、盐酸、无水乙醇(北京化工厂;槲皮素、姜黄素(国药集团化学试剂有限公司;原花青索(西安小草植物科技有限公司;六水合三氯化铁、醋酸钠(广东汕头西陇化工厂。以上所有试剂均为分析纯,超纯水用来配制试剂。
U V-9100型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司;M uli t i s k an M K3酶标仪;96孔微量滴定板等。
1.2方法
1.2.1A B T S法A B TS+自由基的制备\小1按照原始方法并略有改动,将5m l的7m m ol/L A B T S和88m的140m m ol/L过硫酸钾混合,于室温、避光的条件下反应,静置过夜,最终形成A B T S+自由基储备液。A B T S与过硫酸钾的化学反应剂量是2:1,在反应体系中,A B TS氧化不完全使得体系更加趋于稳定。储备液在使用前,为了取得最佳反应条件,要求至少停留12—16h;在使用时需用无水乙醇将其稀释成A B TS+自由基工作液,两工作液的要求是30℃,734nm波长下,吸光度为(0。70±0.02。
Tr ol ox系列浓度溶液配制准确称取Tr ol ox0.01259,然后使用无水乙醇依次将其配制成80、120、200、300、400、500、600、700和800pm ol/L的系列浓度溶液备用。
受试物系列浓度溶液配制槲皮素、姜黄素、D L廿生育酚和原花青素按照预实验结果,将其配成浓度在10—1000Ⅲnol/L和0.25~l i ng范围内的适宜系列浓度溶液,并要求在各浓度下具有20%一80%清除自由基的效能。
抗氧化活性的测定取A B T S+自由基工作液4m l置于10m l具塞比色管中,分别加入80出的Tr ol ox或其它受试物溶液。均匀振荡10s,300C水浴反应6ra i n,测定其各自吸光度值,平行样3支,取平均值计算。测定结果以受试物清除自由基的能力与Trol ox清除自由基的能力相对比得到,单位为Tm l ox 抗氧化活性当量(Tr ol ox
几种生物活性物质体外抗氧化能力评价技术的研究解读
