LiCl溶液中基于固态纳米孔的DNA检测
沙菁 石鸿佼 徐 冰
【摘 要】摘要：采用阳离子体积较小的LiCl溶液作为缓冲液,研究DNA在不同浓度下通过固态纳米孔时的行为特征,以探究DNA的过孔机理.实验结果表明,当LiCl溶液浓度从0.1 mol/L变化到1.0 mol/L时,由DNA过孔所引起的相对阻塞离子电流信号比值从0.014 42降低至0.002 79,而DNA完全通过纳米孔所需时间从0.30 ms增加至1.87 ms.对比1 mol/L KCl,NaCl,LiCl三种溶液中DNA的过孔结果发现,在LiCl溶液中DNA的过孔时间分别为KCl,NaCl溶液中的6.2和5.3倍,说明LiCl溶液能够有效降低DNA的过孔速度.此外,实验发现LiCl溶液中DNA主要以线性非折叠和折叠2种形态过孔． 因此,增加LiCl溶液浓度可延长DNA的过孔时间,但会使相对阻塞离子电流信号幅值降低. 【期刊名称】东南大学学报（自然科学版） 【年(卷),期】2016(046)005 【总页数】5
【关键词】纳米孔;LiCl溶液;DNA;阻塞离子电流;过孔时间
纳米孔测序技术是下一代基因测序技术中最可行的技术方案之一,主要是通过物理方法直接对DNA序列进行读取.纳米孔测序技术的原理可以简单描述为: 单个生物分子通过充满离子溶液的纳米孔通道时,会引起通道内电学性质的变化,通过分析离子电流的阻塞信号,可实现单分子检测,甚至是DNA 中4种碱基的辨识[1].纳米孔测序技术具有结构简洁、速度快、操作简便等特点,故而得到了广泛的关注[2].
目前,固态纳米孔大都利用硅及其衍生物制造而成,一般使用离子束或电子束在硅
或其他材料薄膜表面加工出纳米尺度的孔径,再进一步对孔的形状和大小进行修饰.与生物纳米孔相比,固态纳米孔具有高稳定性、孔径大小和通道长度可控、可调节的表面特性以及可与设备结合的优势[3-5].
纳米孔测序技术的关键在于对DNA穿过纳米孔机理的分析,即对DNA通过纳米孔所引起的阻塞离子电流信号进行辨识检测.对过孔信号起主要影响作用的是缓冲溶液中的正离子,目前的实验研究一般在KCl或NaCl溶液中进行,但K+和Na+的离子半径较大,与DNA表面的吸附力不强,在DNA通过纳米孔时容易脱落[6].为了深入研究纳米孔的过孔机理,本文将LiCl溶液作为缓冲液,研究了不同溶液浓度下 DNA通过Si3N4纳米孔的行为特征.
1 实验材料和方法
1.1 纳米孔的制备
本实验使用了Si3N4固态纳米孔.其加工步骤如下: ① 利用低压化学气相沉积技术,在2.5 mm×2.5 mm×0.4mm的硅基底上沉积一层100 nm厚的Si3N4薄膜.② 采用光刻技术和反应离子刻蚀的方法,在Si3N4薄膜一侧的中心处加工出一个720 μm×720 μm的正方形窗口.③ 通过湿法刻蚀技术,在硅基底上刻蚀出一个160 μm×160 μm的深槽,且刻蚀到Si3N4薄膜时停止.此时,该刻蚀部分薄膜下硅基底已被完全腐蚀,薄膜处于悬空状态.④ 在膜的中心区域1 μm×1 μm正方形内,利用离子束刻蚀技术将薄膜减薄至10nm 左右.⑤ 在减薄区域采用离子束刻蚀技术加工出一个直径约30 nm的纳米孔.
为了减弱实验过程中电介质产生的干扰噪声,将纳米孔芯片浸泡在125 ℃的食人鱼溶液(V(H2SO4)∶V(H2O2)=3∶1)中30 min,并用去离子水清洗3遍;然后,以高纯氮气吹干表面水渍,同时在孔口附近涂上一层薄PDMS[7].
1.2 实验原理与方法
实验原理示意图如图1所示．纳米孔将导电的电解质溶液分成2个区域.通过施加外电场,产生通过纳米孔的基准离子电流.当生物分子通过纳米孔时,离子电流被部分阻塞,根据离子电流的波动便可分析生物分子的信息.在本实验中,被检测的生物分子为λDNA,它是一种长度为48.5 kbp的双链DNA,直径为2.2 nm,等电位为3.5～4.0．当溶液pH=8.0时,DNA表面带负电.因此,施加相应电场时,DNA在电场力的驱动下可以通过纳米孔.
实验在pH=8.0的LiCl溶液中进行,实验装置示意图如图2所示.首先,在2个液池中加入LiCl溶液.为了使2个液池间的离子运动只发生在纳米孔内,将孔的两端垫上橡胶垫圈密封,并将其与液池组装在一起,使各孔中心在一条直线上, 从而保证其密封性. 将λDNA(购于Takara公司) 添加在液池的cis端,2个Ag/AgCl电极插入液池中,并连接到HEKA膜片钳放大器(HEKA EPC10)上,以100 kHz采样频率、10 kHz低通道滤波频率来检
测离子电流.为屏蔽外来电噪声的影响,实验在法拉第笼中进行.
2 实验结果和分析
2.1 阻塞离子电流信号幅值
DNA过孔时的阻塞离子电流大小主要由DNA占位体积决定,但壁面电荷、DNA带电量、溶液浓度梯度等也会对其产生影响[8-10].下面研究LiCl溶液浓度为1.0,0.5,0.1 mol/L时DNA过孔导致的阻塞离子电流信号幅值变化. 如图3(a)所示,当施加电压V0=1 000 mV时,不同LiCl溶液浓度下DNA过孔所造成的阻塞离子电流信号幅值接近,峰值均为650 pA左右,从事件百分比上看，无法区分不同浓度的LiCl溶液中DNA过孔情况,而利用相对阻塞离子电流信号
LiCl溶液中基于固态纳米孔的DNA检测
