小时)时，会出现菌落粘稠、血清凝集假阴性现象； ? 故应取新鲜培养物(10～14h)作凝集试验，凝集的菌落立即转种营养琼脂平板。
? 小川型菌株有时在稻叶型单价血清中可出现弱凝集，这并非彦岛型，而是小川型含有少量C抗原成分的缘故； ? 首例病人应以两个单价血清的试管凝集试验确定。 六、初步鉴定试验：
1.氧化酶试验：在非选择性或非鉴别性培养基如营养琼脂的新鲜培养物上滴加氧化酶试剂1滴，并使其流开。或将菌落用竹签或牙签挑至滴有试剂的滤纸上，在1分钟内出现粉红－紫红－紫蓝色（有的最后呈黑紫色）为氧化酶阳性。
（肠杆菌科细菌多不变色或变成粉红色后很快退色为氧化酶阴性）。 氧化酶试验注意事项：
试验时避开含铁物质（如接种环）。不能直接取产酸培养基上的菌落，不能取含还原剂的培基及含亚碲酸盐培基上的菌落(亚碲酸盐培养基可抑制氧化酶)，以免出现假阳性和假阴性。
2.拉丝试验：在玻片上加一滴试剂，取一接种环被检菌的新鲜琼脂培养物在试剂旁边研磨均匀，再与试剂混合制成浓厚悬液。阳性者很快(30S内)由混变清并变得很粘稠，用接种环挑取时，可以拉出细丝来。 阴性者呈均匀悬液状态，与蒸馏水对照相同。（古典型、埃尔托型和O139群霍乱弧菌均阳性。）
弧菌科菌属氧化酶试验、拉丝试验鉴别表
弧菌科 O1群霍乱弧菌 O139霍乱弧菌 NAG弧菌 河弧菌 霍利斯弧菌 弧 菌 属 少女鱼弧菌 (目前发现具 弗尼斯弧菌 致病性弧 副溶血弧菌 菌) 溶藻弧菌 拟态弧菌 麦氏弧菌 创伤弧菌 辛辛那提弧菌 气单胞菌属 气单胞菌 邻单胞菌属 类志贺邻单胞菌
氧化酶试验 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ 拉丝试验 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ (80%) ＋ ＋ (64%) ＋ (91%) ＋ ＋ ＋ ＋ － (90%) － 3.O/129(二氨基二异丙基喋啶)敏感试验：
? 用接种环或灭菌棉拭子在含0.5％氯化钠的普通平皿上均匀涂抹待检菌，放上10μg、150μgO/129磷酸盐药敏纸片各一片，37℃培养过夜。凡药敏纸片周围出现抑菌圈者为敏感。 ? 古典型、埃尔托型霍乱弧菌二者均敏感； ? O139群霍乱弧菌10μg、150μg均不敏感。 七、初步结果报告：
? 霍乱弧菌以血清学鉴定为主，结合菌落形态、特征和初步生化反应可做出 判定。
凡具备弧菌菌落特征、与O1群或O139群多价血清凝集，O1群
并可用单价血清分型即可判定。
? 首例病人应辅以氧化酶、拉丝试验、O/129敏感试验。基层CDC至此即可上报。
? 上报国家需做生化、噬菌体-生物分型试验。
? 报告名称－－“稻叶/小川型O1群埃尔托型霍乱弧菌”或“O139群埃尔托型霍乱弧菌”。 八、 生化鉴定试验：
试验项目 氧化酶 粘丝 O1群 O139群 NAG 试验项目 + + + + + + + + + + - - + + 甘露糖 阿拉伯糖 肌醇 赖氨酸脱羧酶 O1群 O139群 NAG + - - + + - - + + - + + +/- - - - +/- - - + + - + + +/- - - + O/129敏感(10μg) + O/129敏(150μg) 动力 靛基质 V-P 甲基红 硝酸盐还原 葡萄糖产酸 葡萄糖产气 蔗糖
感+ + + 鸟氨酸脱羧酶 + 精氨酸双解酶 - + + +/- - - - +/- + + + + - + - + + - + +/- 0％盐胨水 -/+ 3％盐胨水 + + - 6％盐胨水 8％盐胨水 10％盐胨水 +/- 山梨醇 九、噬菌体-生物分型： 1. 古典型和Eltor分型：
? 目前仍依靠第IV组霍乱噬菌体常规稀释液(106/毫升)裂解试验、多粘菌素B敏感试验、鸡血球凝集、V-P和溶血试验进行
两种生物型的鉴别仅作参考。
? 埃尔托型已出现大量非溶血菌株，因此溶血试验已不能作为区别两个生物型的主要方法。
O1群霍乱弧菌古典型和El-Tor生物型的鉴别
鉴 别 试 验 1.第IV组VC噬菌体(106/ml) 2.多粘菌素B敏感 3.鸡血球凝集 4.V-P 5.溶血 注：括弧内为少数菌株结果。 O1群霍乱弧菌生物型 鉴 别 试 验 古典型 1.第IV组VC噬菌体(106/ml) 2.多粘菌素B敏感 3.鸡血球凝集 4.V-P 5.溶血 注：括弧内为少数菌株结果。 ＋ ＋ －(＋) － － 埃尔托型 －(＋) －(＋) ＋(－) ＋(－) ＋/－ O1群霍乱弧菌生物型 古典型 ＋ ＋ －(＋) － － 埃尔托型 －(＋) －(＋) ＋(－) ＋(－) ＋/－ (1)噬菌体分型：
? 根据五株国内分离的5种弧菌噬菌体 (VP1～VP5)将埃尔托型霍乱弧菌分成32个噬菌体型 (见下表)。
方法：利用双层琼脂平皿法进行噬菌体滴皿裂解试验。
噬菌对分型噬菌体的敏感性 噬菌对分型噬菌体的敏感性 体型 VP1 VP2 VP3 VP4 VP5 体型 VP1 VP2 VP3 VP4 VP5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ － － － ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ － ＋ － － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ － ＋ ＋ － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ － ＋ 17 ＋ 18 ＋ 19 ＋ 20 ＋ 21 － 22 ＋ 23 ＋ 24 ＋ 25 ＋ 26 ＋ 27 ＋ 28 － 29 － 30 － 31 － 32 － － － ＋ － － ＋ － ＋ ＋ － － － － ＋ － － － ＋ － － ＋ － ＋ － ＋ － － － ＋ － － － ＋ － － ＋ － － ＋ ＋ － － － ＋ － － － ＋ － － － ＋ ＋ ＋ － － － － ＋ － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － ＋ － － － － － (2)生物分型：
? 根据菌株的溶原性、对溶原噬菌体的敏感性、山梨醇发酵试验和溶血试验等四个生物学性状，将埃尔托弧菌分成12个生物型 。
埃尔托霍乱生物分型表
霍乱弧菌的分离与鉴定
