中国中医眼科杂志2024年2月第30卷第2期
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·论著：实验研究·
人参皂苷Rg3对VEGF诱导的RF/6A细胞
增殖与迁移能力的影响
褚文丽1，2，陈水龄1，亢泽峰1，刘健1，李维义3，陶方方4
[摘要]目的探讨中药单体人参皂苷Rg3对血管内皮生长因子（VEGF）刺激下的猴脉
利用不同浓度VEGF分别在
络膜-视网膜内皮细胞（RF/6A）增殖与迁移能力的影响。方法
不同时间干预刺激RF/6A细胞，采用CCK-8法检测细胞增殖情况，筛选VEGF最佳干预浓度及干预时间；应用不同浓度康柏西普干预VEGF刺激下的RF/6A细胞，观察筛选康柏西普最强作用浓度；应用低、中、高浓度人参皂苷Rg3和康柏西普干预VEGF刺激下的RF/6A细胞，采用CCK-8法检测各干预对细胞增殖的影响；采用细胞划痕实验检测人参皂苷Rg3
CCK-8法检测结果显示，
不同时间点，不同浓度VEGF刺激培养对细胞的增殖影响不同，其中，50ng/mLVEGF刺激RF/6A细胞48h后，细胞增殖率最大；不同浓度康柏西普干预结果显示，0.5μg/mL即能有
效抑制VEGF刺激下RF/6A细胞的增殖（t=-3.147,P=0.035）；低、中、高浓度人参皂苷Rg3及康柏西普组均能抑制VEGF诱导的RF/6A细胞增殖（F=26.546,P=0.000），其中，康柏西普组抑制作用强于人参皂苷Rg3各浓度组。细胞划痕实验各组的迁移率比较，干预培养24h后，联合组对细胞移行的抑制作用强于人参皂苷Rg3组（t=4.639,P=0.010），康柏西普组的抑制作用亦强于人参皂苷Rg3组（t=4.350，P=0.012），而两组间比较无统计学意义（P＞0.05）；继续培养至48h，康柏西普和人参皂苷Rg3组均能抑制细胞迁移，但差异无统计学意义（P＞0.05），均低于联合组（t=8.543，P=0.001；t=3.067，P=0.037）。结论应用抑制作用最强。
和康柏西普对VEGF刺激下RF/6A细胞迁移能力的影响。结果
VEGF能够促进RF/6A细胞的增
殖和迁移，中药单体人参皂苷Rg3和康柏西普均具有抑制这一增殖和迁移的作用，且联合
[关键词]人参皂苷Rg3；RF/6A细胞；血管内皮生长因子；细胞增殖；细胞迁移
中图分类号：R778.1+1
文献标识码：A
文章编号：1002-4379（2024）02-0089-06
EffectofGinsenosideRg3onproliferationandmigrationofRF/6AcellsinducedbyVEGFCHUWenli,CHENShuiling,KANGZefeng,etal.EyeHospital,ChinaAcademyofChi-neseMedicalSciences,Beijing100040,China
[Abstract]OBJECTIVEToinvestigatetheeffectofChinesemedicineGinsenosideRg3ontheproliferationandmigrationabilityofmonkeychoroid-retinalendothelialcells(RF/6A)stimu-latedbyvascularendothelialgrowthfactor(VEGF).METHODSDifferentconcentrationsof
VEGFwereusedtostimulateRF/6A
DOI:10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2024.02.004基金项目：1国家自然科学基金（81574032）
cellsatdifferenttimes,andCCK-8methodwasusedtodetectcellprolif-erationandoptimalconcentrationandtimeofVEGF.DifferentconcentrationsofConberceptwereusedtointerveneinRF/6AcellsstimulatedbyVEGF,andthebestconcentrationofConber-ceptwasobservedandscreened.Low,
2国家中医药管理局岐黄工程亢泽峰歧黄学者工作室项目3深圳市医疗卫生三名工程（SZSM202412090）4北京市石景山区亢泽峰名医传承工作室项目
作者单位：1中国中医科学院眼科医院，北京100040
2北京市隆福医院，北京1000103深圳市眼科医院，深圳5180404中国中医科学院西苑医院，北京100091
通讯作者：亢泽峰，E-mail：Zefeng2531@163.com
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mediumandhighconcentrationsofGinsenosideRg3andConberceptwereusedtointerveneinRF/6AcellsstimulatedbyVEGF,CCK-8methodwasusedtodetecttheeffectofinterventiononcellproliferation;CellscratchtestwasusedtodetecttheeffectofginsenosideRg3andConberceptonmigrationofRF/6AcellsstimulatedbyVEGF.RESULTSTheresultsofCCK-8methodshowedthatatdifferenttimepointsanddifferentconcentrationsofVEGFstimulatedcul-turehaddifferenteffectsoncellproliferation.Amongthem,thecellproliferationratewasthelargest,when50ng/mLVEGFstimulatedRF/6Acellsfor48h;Theresultsofdifferentcon-centrationsofConberceptinterventionshowedthat0.5μg/mLcouldeffectivelyinhibittheprolif-erationofRF/6AcellsstimulatedbyVEGF(t=-3.147,P=0.035);Low,mediumandhighconcen-trationsofRg3andConberceptgroupcouldinhibittheproliferationofRF/6AcellsinducedbyVEGF(F=26.546,P=0.000).And，theinhibitoryeffectoftheConberceptgroupwasstrongerthanthatoftheRg3eachconcentrationgroup.Comparisonofthemobilityofeachgroupinthecellscratchtestshowedthatafter24hinterventionculture,thecombinedgrouphadastrongerin-hibitoryeffectoncellmigrationthantheRg3group(t=4.639,P=0.010;t=4.350,P=0.012),therewasnostatisticallysignificantdifferencebetweenthetwogroups(P>0.05);Butcontinuedtoculturefor48h,boththeConberceptandRg3groupscouldinhibitcellmigration,therewasnostatisticalsignificance(P>0.05),butallwerelowerthanthecombinedgroup(t=8.543,P=0.001;t=3.067,P=0.037).CONCLUSIONSVEGFcouldpromotetheproliferationandmigrationofRF/6Acells.BothGinsenosideRg3andConberceptcouldinhibittheproliferationandmigrationofRF/6Acells,andthecombinedapplicationhadthestrongestinhibitioneffect.
[Keywords]ginsenosideRg3;RF/6Acells;VEGF;proliferation;migration
人参皂苷Rg3（ginsenoside，Rg3）是人参生物活性和药理作用的主要药效成分之一，具有抗肿瘤、抗血管生成、提高机体免疫力等药理作用，单用Rg3即可抑制肿瘤的血管生成，和化疗药联合应用具有增效的作用，被广泛应用于肿瘤的临床治疗[1-2]。Rg3成药“参一胶囊”是经国家食品药品监督管理局批准上市的肿瘤新生血管抑制剂，适用于肺癌、胃癌、结肠癌及食道癌等多种恶性肿瘤[3-4]。大量研究显示
白酶（美国Gibco公司），二甲基亚砜DMSO（美国
Amresco公司），PBS磷酸盐缓冲液（北京索莱宝科
技有限公司），青链霉素（北京源博汇科技术研究所），CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所），重组人
VEGF165蛋白（美国PEPROTECH公司，AF100-20），0.4%台盼蓝染色液（北京索莱宝科技有限公司），4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司），0.1%草酸铵
结晶紫染色液（北京索莱宝科技有限公司）。
Rg3同样能够抑制眼部新生血管的生成，且应用及
研究多集中角膜和视网膜[5-6]，仅有少量研究证实其对脉络膜新生血管（choroidalneovascularization，1.1.2主要仪器5%CO2培养箱（ThermoFisherScientific，美国），全自动酶标仪（Thermo，美国），荧光倒置显微镜（Olympus，IX81），超净工作台（西安永
乐精密机械有限公司），台式高速离心机（Eppen-
CNV）生成具有抑制作用[7]。本研究以RF/6A细胞为研究对象，通过采用体外促血管生成因子-血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）
刺激培养RF/6A细胞，诱导其增殖，予以人参皂苷
dorf，德国），4℃离心机（德国），精密电子天平
（AUW220，SHIMADZU），细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司），-80℃冰箱（SANYO，日本），恒温水浴锅（AISETYLJYE-100，上海亚泰仪表有限公司）。
Rg3进行干预，观察Rg3对其增殖和移行的影响，探讨评价人参皂苷Rg3对CNV形成的抑制作用。11.11.1.1
材料与方法材料
主要试剂DMEM高糖培养基（美国Gibco公
1.1.3材料和药品RF/6A细胞（武汉普诺赛生命科
R技有限公司，批号：ATCCCRL-1780TM），人参皂苷
Rg3（中国食品药品检定研究院，ID：F0Z7-Z25D），康
柏西普眼用注射液（成都康弘药业，批号：
司），胎牛血清FBS（美国Gibco公司），0.25%胰蛋
S20130012）；Rg3溶液配制：将Rg3粉剂溶于DMSO，
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配制成终浓度为50mmol/L的母液，分装后于4℃保存备用。临用前用DMEM基础培养基将母液稀释到所需浓度，DMSO终浓度不超过0.01%。康柏西普溶液配制：临用前用DMEM培养基将其稀释所需浓度。VEGF165配制：将VEGF165粉剂溶于无菌水，配置成0.1mg/ml母液，－20℃保存备用。临用前用
1.2.5细胞划痕实验检测Rg3及康柏西普对VEGF
刺激RF/6A细胞移行的影响细胞以1×105/ml密度接种到于24孔板，每孔体系为2ml，常规培养24h后，弃上清，加入DMEM高糖基础培养基，将无菌直尺放在24孔板表面，用20μl微量加样枪头垂直于
24孔板，在板孔低均匀行“|”形划痕制作损伤划痕。
划痕后用PBS冲洗2～3遍，以去除脱落悬浮的细胞，加入无DMEM基础培养基于显微镜下拍照记录（此时为0h）。拍照后，根据实验分组分别加入10μl最佳刺激浓度VEGF165及10μlRg3或康柏西普，具有实验分组依次为：（1）正常细胞组：细胞正常培养；（2）VEGF组：RF/6A细胞+VEGF；（3）康柏西普组：RF/6A细胞+VEGF+康柏西普组；（4）人参皂苷
10?S将母液稀释到一定浓度，再用DMEM培养
基稀释到所需浓度。
1.2方法
1.2.1RF/6A细胞的培养将RF/6A细胞接种至25cm2培养瓶中，加入5%胎牛血清的DMEM高糖
培养基常规培养，根据细胞生长情况，每3～4d传代
1次。取对数生长期的RF/6A细胞进行消化、重悬、
计数，用于实验。
Rg3组：RF/6A细胞+VEGF+Rg3；（5）联合组：RF/6A
细胞+VEGF+康柏西普+Rg3；继续孵箱培养24h、48h后，倒置显微镜下观察并记录各孔细胞向划痕区域迁移情况，测量划痕裸区（细胞未覆盖区）的宽度，即损伤一侧边缘到另一侧边缘的宽度，边缘的界定是以移行离开初始划行线最远而又和其他细胞相连的细胞为准。利用Image-ProPlus软件测量并计算迁移率。迁移率=（L0-Lt）/L0×100％（L0：起始划痕裸区宽度，Lt：各时间点划痕裸区宽度）。
1.2.2
CCK-8法检测不同浓度VEGF对RF/6A细胞
增殖的作用取对数生长期的RF/6A细胞，以1×105/ml
密度接种于96孔板，每孔200μl，于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h，弃上清，加入基础培养基饥饿
12h后弃培养基，分别加入20μl终浓度为0、10、25、50、100ng/mlVEGF和180μl完全培养基，另设空白细胞孔（只有完全培养基），每个浓度设3个复孔，分别培养12h、24h、48h和72h后，每孔加入CCK-8溶液20μl，继续孵育4h后置酶标仪上，在450nm波长处测定每孔的吸光度值（OD值）。1.2.3
CCK-8法检测不同浓度康柏西普对VEGF
刺激RF/6A细胞增殖的影响实验方法同1.2.2，
1.2.6统计学分析
运用SPSS20.0软件和GraphpadPrism5.0进行
统计分析和做图，计量资料用均值±标准差（x軃±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
VEGF干预浓度50ng/ml，康柏西普干预浓度分别为0.5、1.5、4.5、13.5、40.5ug/ml，作用时间为48h。观察
不同浓度康柏西普对VEGF诱导的RF/6A细胞增
殖的影响，选择康柏西普的最佳抑制作用浓度，用于后续实验。
2结果
2.1RF/6A细胞形态
于倒置显微镜下观察，RF/6A细胞贴壁生长，呈扁平梭状或多角形状，大小形态较为均匀一致（图1）。细胞常规传代培养1d后，可见细胞80％融合，生长旺盛，继续培养3d后，可见细胞状态汇合至90％，排列规则，本次实验所用RF/6A细胞为复苏后传代至第3～5代细胞。
1.2.4CCK-8法检测不同浓度Rg3对VEGF刺激
的RF/6A细胞增殖的影响细胞常规接种饥饿后弃培养基，根据分组分别加入最佳刺激浓度VEGF以及不同浓度的Rg3和康柏西普，补足完全培养基，其分组依次为：（1）正常细胞组RF/6A细胞正常培养；（2）VEGF组RF/6A细胞+VEGF；（3）康柏西普组
2.2不同浓度VEGF对RF/6A细胞增殖的作用
RF/6A细胞+VEGF+康柏西普组；（4）Rg3低浓度组RF/6A细胞+VEGF+Rg3低浓度；（5）Rg3中浓度组RF/6A细胞+VEGF+Rg3中浓度；（6）Rg3高浓度组RF/6A细胞+VEGF+Rg3高浓度；每组设3个复孔，分别培养48h后，每孔加入CCK-8溶液20μl，继续孵育4h后置酶标仪上，在450nm波长处测定每
孔的吸光度值（OD值）。
图1
1A1B
光学显微镜下RF/6A细胞形态学特征。1A×40倍；1B×100倍
人参皂苷 Rg3 对 VEGF 诱导的 RF/6A 细胞<p>增殖与迁移能力的影响</p><p><br/></p>
