(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110396558 A(43)申请公布日 2019.11.01
(21)申请号 201910371699.5(22)申请日 2019.05.06
(71)申请人 中国水产科学研究院南海水产研究
所
地址 510300 广东省广州市海珠区新港西
路231号(72)发明人 苏浩昌 曹煜成 文国樑 胡晓娟
徐煜 徐武杰 杨铿 孙卫芳 黄小帅 (74)专利代理机构 广州知友专利商标代理有限
公司 44104
代理人 宣国华 刘艳丽(51)Int.Cl.
C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/689(2018.01)
(54)发明名称
一种同时检测养殖对虾五种典型病原的多重巢式PCR扩增引物及试剂盒(57)摘要
本发明公开了一种同时检测养殖对虾五种典型病原的多重巢式PCR扩增引物，包括五种病原SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VPAHPND的引物组，其中：所述引物组的核苷酸序列如SEQ?IDNO.1～20所示，本发明还公开了包含上述引物的试剂盒以及采用上述引物检测五种病原的非疾病检测目的多重巢式PCR检测方法，通过设计外扩和内扩引物，优化并确定外扩和内扩反应的退火温度、dNTP、EX?Taq?enzyme、五种对虾病原引物的PCR反应浓度等参数，一方面保证可满足同时检测对虾养殖生产危害较大的SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VPAHPND等五种病原的需求，另一方面可达到较高的灵敏度。
C12Q 1/6848(2018.01)C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01)C12R 1/63(2006.01)
权利要求书2页 说明书12页
序列表4页 附图2页
CN 110396558 ACN 110396558 A
权 利 要 求 书
1/2页
1.一种同时检测养殖对虾五种典型病原的多重巢式PCR扩增引物，其特征是包括五种病原SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VPAHPND的引物组，其中：
所述病原SHIV的外扩引物序列如SEQ?IDNO.1～2所示；所述病原SHIV的内扩引物序列如SEQ?IDNO.3～4所示；所述病原EHP的外扩引物序列如SEQ?IDNO.5～6所示；所述病原EHP的内扩引物序列如SEQ?IDNO.7～8所示；所述病原WSSV的外扩引物序列如SEQ?IDNO.9～10所示；所述病原WSSV的内扩引物序列如SEQ?IDNO.11～12所示；所述病原IHHNV的外扩引物序列如SEQ?IDNO.13～14所示；所述病原IHHNV的内扩引物序列如SEQ?IDNO.15～16所示；所述病原VPAHPND的外扩引物序列如SEQ?IDNO.17～18所示；所述病原VPAHPND的内扩引物序列如SEQ?IDNO.19～20所示。
2.一种同时检测养殖对虾五种典型病原的多重巢式PCR检测试剂盒，其特征是：包括外扩反应液、内扩反应液、阳性对照和阴性对照；其中所述外扩反应液包括权利要求1中的外扩引物、dNTP、EX?Taq?enzyme和ddH2O，所述内扩反应液包括权利要求1中的内扩引物、dNTP、EX?Taq?enzyme和ddH2O。
3.根据权利要求2中的试剂盒，其特征是：所述外扩反应液为25μL反应体系，其中：dNTP浓度为1.5mmol/L，EX?Taq?enzyme?1.5U，SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VPAHPND五种典型病原的外扩上下游引物浓度均为0.32μmol/L；所述内扩反应液为25μL反应体系，其中：dNTP浓度为1.5mmol/L，EX?Taq?enzyme?1.5U，SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VPAHPND五种典型病原的内扩上下游引物浓度均为0.48μmol/L。
4.采用权利要求3中所述引物检测养殖对虾五种典型病原的非疾病检测目的多重巢式PCR检测方法，其特征是包括以下步骤：
(1)构建阳性质粒DNA作为对照；(2)提取待测样品的DNA；(3)外扩PCR反应：构建外扩PCR反应体系和外扩PCR反应程序，进行外扩PCR反应，获得外扩产物，并以各病原的阳性质粒DNA和无菌水分别作为阳性和阴性对照；
(4)内扩PCR反应：构建内扩PCR反应体系和内扩PCR反应程序，对稀释后的外扩产物进行内扩PCR反应，获得内扩产物；
(5)PCR结果判断：采用电泳检测内扩产物，如出现和阳性对照片段大小一致的阳性条带，则该生物样品携带相应的目标病原。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是：步骤(3)中所述外扩反应体系为25μL反应体系，其中：dNTP浓度为1.5mmol/L，EX?Taq?enzyme?1.5U，SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VPAHPND五种病原的外扩上下游引物浓度均为0.32μmol/L。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征是：步骤(3)中所述的外扩反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，61℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征是：步骤(4)中所述内扩反应体系为25μL反应体系，其中：dNTP浓度为1.5mmol/L，EX?Taq?enzyme?1.5U，SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VPAHPND五种病原的内扩上下游引物浓度均为0.48μmol/L。
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CN110396558A一种同时检测养殖对虾五种典型病原的多重巢式PCR扩增引物及试剂盒[专利] - 图文
