RT-PCR检测CK19 mRNA青年结直肠癌患者淋巴结微转移
目的 利用RT-PCR检测CK19 mRNA技术，从分子水平探讨在青年结直肠癌患者区域淋巴结微转移的价值及临床意义。方法 采用RT-PCR扩增，对角蛋白CK19检测。对30例结直肠癌患者的癌组织标本和108个淋巴结进行检测，检测良性结直肠疾病（结直肠息肉、憩室等）手术的20例患者的正常肠周淋巴结20枚作为对照组，同时行常规病理检查。结果 30例结直肠癌患者均有CK19 mRNA表达，108个淋巴结中有47个存在CK19 mRNA阳性表达，阳性率为43.5%；常规病理检查有25枚有癌转移，阳性率为23.2 %；20例良性病变患者30枚淋巴结CK19 mRNA表达为阴性。结论 RT-PCR扩增CK19 mRNA检测结直肠癌区域淋巴结微转移，是一种敏感而特异性的检测方法，对青年结直肠癌患者指导治疗，有较大的临床意义。
标签： 青年结直肠癌； 微转移； 淋巴结； 聚合酶链反应
结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，且有年轻化趋势。外科手术治疗依旧是首选方法。但根治术后易复发，影响了术后5年生存率。因此对于结直肠癌诊治的研究也空前提高。其中淋巴结转移是影响结直肠癌患者预后的最重要因素之一。近几年来，不少学者通过研究结直肠癌淋巴结的微转移(micrometastasis，MM)来提高结直肠癌治疗效果以期改善预后，提高5年生存率。细胞角蛋白（cytokeratin,CK）是细胞骨架系统中间丝组成成分之一。广泛存在于上皮组织细胞中，而间叶组织中缺乏表达，故成为上皮肿瘤细胞较为敏感和特异的指标。由于它在正常淋巴结中不表达，因而最常用来检测微转移的标记物［1］。RT-PCR被认为是检测隐匿性癌转移的高度敏感的方法。本文探讨RT-PCR检测CK19 mRNA在诊断青年（40岁以下）结直肠癌患者区域淋巴结微转移的价值及其临床应用。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2007年9月-2011年9月在本科行结直肠根治性切除40岁以下结直肠癌患者30例行根治术，排除合并其它脏器肿瘤或术前行辅助化疗的病例。其中男17例，女13例；所有病例临床病理特征根据1997年UICC淋巴结分类，Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲ期7例，Ⅳ期5例。共采集肿瘤标本的30例，淋巴结108个。另取同期因良性结直肠疾病（结直肠息肉、憩室等）手术的20例患者的正常肠周淋巴结20枚作为对照组。每个新鲜淋巴结标本平均分为两块(每次切开淋巴结之前，用生理盐水冲洗刀片，以免造成污染)，一块用福尔马林固定，石蜡包埋后切片行常规病理检查(HE染色)；另一块经液氮速冻后-80 ℃保存用于提取RNA。对于常规病理检查无淋巴结转移患者的淋巴结标本提取RNA。
1.2 引物设计 引物由上海生工公司合成。CK19引物的序列设计为5′-AAGAAAACCCGAAGAGGCC-3′，5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，引物长度221 bp。
1.3 总RNA抽提及鉴定 30例结直肠癌组织，108枚淋巴结和20例正常组织分别加入提起试剂（Invitrogen）1 ml,电动匀浆1~2 min，匀浆液室温放置5 min后加氯仿200 μl，震荡15 s，12000 r/min，4 ℃离心15 min。上层水相移入另一个Eppendorf管中，加入异丙醇500 μl混匀室温放置10 min。4 ℃ 12000 r/min，离心15 min，弃掉上清，加1 ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，7500 r/min， 4 ℃离心5 min，弃掉上清。
1.4 RT-PCR 在美国产MJ-Research扩增仪上，将反应体系混匀后进行扩增，逆转录体积为50 μl。扩增步骤如下：（1）42 ℃孵育30 min；（2）95 ℃孵育3 min；（3）95 ℃预变性10 s；（4）55 ℃预变性30 s；（5）72 ℃ 1 min ；（6）重复3~5步骤4次；（7）95 ℃预变性5 s；（8）60 ℃预变性30 s；（9）读取；（10）重复7~9步骤35次；（11）；40 ℃预变性1 s。用紫外分光光度仪定量观察并照相记录结果。
1.5 统计学处理 统计学处理应用软件SPSS 13.0完成，计数资料采用χ2分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
患者常规病理组织学方法检查确诊为结直肠癌患者，RT-PCR法同时检测30例结直肠癌患者大体标本均有CK19 mRNA表达；108个淋巴结中有47个存在CK19 mRNA阳性表达，阳性率为43.5%；常规病理检查有25枚有癌转移，阳性率为23.2 %。RT-PCR方法和常规病理（HE染色）方法比较差异有统计学意义（P＜0.05）；20例良性病变患者30枚淋巴结中CK19 mRNA表达均为阴性。CK19 mRNA在结直肠癌组织及淋巴结中表达见图1。
结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一。在我国近20年来尤其在大城市发病率明显上升，且有年轻化趋势。虽然目前结直肠癌治疗疗效较过去已经明显提高，但复发和转移依旧是治疗失败的主要原因之一，常规病理未发现淋巴结转移，术后复发率高达近一半［2］。微转移是指在非血液系统恶性肿瘤的发展过程中，播散并存活于淋巴系统、骨髓等组织器官中的微小瘤灶，常无临床表现，而这些微小瘤灶正是造成肿瘤转移或复发的重要原因之一，也是目前肿瘤防治中被关注热点之一。目前学术界公认的肿瘤转移概念，分为四种：常规病理HE染色认定的病灶大于2 mm称为转移(metastasis)；0.2 mm<病灶<2 mm称为微转移(micrometastasisMM)；小于0.2 mm的病灶定义为亚显微转移；在单个淋巴结中只有一个转移癌细胞则称为冬眠癌细胞。目前研究认为，可能是淋巴系统、骨髓、肝等组织器官中的微小瘤灶导致结直肠癌临床无法及时和正确治疗。故淋巴结转移是影响结直肠癌预后的最主要因素之一。传统病理学检查是通过对其具有代表性的一个切面经HE染色作普通光镜检查得知的，阳性率较低，漏诊率较高。文献报道漏诊率高达10%～30% ［3］。故寻求高特异性、高敏感性，能准确判断淋巴结有无早期转移具有重要临床意义。随着分子生物技术发展，利用分子生物技术可以发现常规HE染色不能发现的单个癌细胞，正是因为这些微转移可能发展为致命显性，因此微转移的检测目前为人们重视并成为肿瘤研究热点。近年来，随分子生物技术进步，RT-PCR方法因其高度敏感性成为目前监测微转移最令人瞩目的方法。本文试图探讨RT-PCR检测CK19 mRNA在诊断青年（40岁以下）结直肠癌患者区域淋巴结微转移的价值及其应用前景。
RT-PCR技术具有敏感性高、特异性强，简单快速的优点。可在10６~10７个正常细胞中检测出1个癌细胞［4-5］。其检测结果直观，易于判断，避免常规病理学检测时带有的主观性。又因结直肠癌是常见的来源于上皮组织的恶性肿瘤之一，CK是上皮细胞骨架的组成成分，表达在正常的上皮及上皮源性肿瘤及其转移肿瘤细胞，CK家族由分子量为40×103 U~68×103 U不等的20个成员组成。CK19常见的角蛋白之一，它非常局限在胃肠上皮细胞，几乎所有结直肠癌都明显的表达。CK19是上皮细胞细胞的标志性基因，已有研究表明CK19在结直肠癌细胞株的表达高达100%，且在侵袭、转移、扩散到其它组织器官始终保持稳定性。故可作为结直肠在淋巴结、骨骼和外周血等间叶组织转移的标记物。因其具有较高的敏感性和特异性而被应用于肿瘤微转移的检测。正常淋巴组织中不表达，结直肠癌区域淋巴结阳性表达表示存在转移，通过检测CK19的表达可监测结直肠癌淋巴转移。本研究利用RT-PCR方法检测结直肠癌区域淋CK19的表达，阳性率为43.5%；常规病理检查，阳性率为23.2 %；良性病变患者表达为阴性，表明RT-PCR技术可以很大程度提高检测的敏感性，降低假阴性。本研究显示，CK19 mRNA在癌组织、有转移的淋巴结中有表达，而在非肿瘤的正常淋巴结不表达，说明CK19 mRNA特异性高，因此CK19可作为结直肠癌区域淋巴结微转移特异性指标。
应用RT-PCR检测CK19 mRNA，对30例结直肠癌患者的癌组织标本和108个淋巴结进行检测，检测良性结直肠疾病（结直肠息肉、憩室等）手术的20例患者的正常肠周淋巴结20枚作为对照组。结果表明30例结直肠癌患者均有CK19 mRNA表达，108个淋巴结中有47个存在CK19 mRNA阳性表达，阳性率为
RT-PCR检测CK19 mRNA青年结直肠癌患者淋巴结微转移
