《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research
煅烧骨/壳聚糖复合材料的制备及表征 ，
·研究原著·
廖 健12，黄晓林3，周 倩1，程余婷1，霍 花1，李 芳1，伍 超1，石前会1，廖运茂2，梁 星2(1贵州医科大学口腔医学院/附属口腔医院，贵州省贵阳市 550004；2四川大学华西口腔医学院，四川省成都市 610041；3中山市人民医院口腔种植科，广东省中山市 528403) DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2306 ORCID: 0000-0003-3519-4485(廖健)
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文章特点— 高温煅烧获表征： (1) 壳聚糖具有良好的生物相容 得煅烧骨 (1)扫描电镜； 性、生物可降解性，但单一组(2)X射线衍射分析； 分的壳聚糖缺乏骨键合的生物 活性，不能直接用于骨组织修壳聚糖按不同(3)傅里叶变换红外吸收光谱分析； (4)采用压汞法测量材料的孔隙率。 复，所以通常被用作辅助材料质量比复合 扫描电镜、X 与其他骨移植材料复合； 射线衍射、傅里叶变换红外吸收光谱等分析复合材料的理化性能进行表征 (2)实验将不同质量的煅烧骨复 合于壳聚糖中，分析复合材料煅烧骨/壳聚万能力学测试机测定复合材料的机械力学性能 的理化性能与细胞相容性。 糖复合材料 体外细胞毒性实验检测复合材料的细胞毒性 文题释义：
天然骨：主要由无机的羟基磷灰石和有机的胶原成分构成，并具有一定的力学性能。以羟基磷灰石和磷酸三钙为主的磷酸盐材料拥有良好的骨传导性和部分骨诱导性，能够与宿主的骨直接发生骨结合，已成为目前临床应用最多的骨移植材料。
锻烧骨：是经高温锻烧异体动物骨所获得的无机材料，主要成分是羟基磷灰石，其钙磷比接近于人骨，拥有极好的生物相容性和优越的骨引导性。与人工合成的羟基磷灰石相比，不用考虑煅烧骨材料的结构形貌，而且材料来源广泛、制作成本低。
摘要
背景：壳聚糖具备优异的理化性能与良好的生物相容性，但其缺乏骨结合的生物活性，需要与其他材料复合用于骨组织修复中。
目的：将煅烧骨与壳聚糖复合，分析其理化性能和细胞毒性。
方法：采用溶液共混法制备煅烧骨与壳聚糖质量比分别为1/2、1/1、2/1的复合材料，表征3种复合材料的理化性能。在第5代小鼠成纤维细胞 L929中分别加入3种复合材料浸提液，CCK-8法检测复合材料的细胞毒性。
结果与结论：①X射线衍射和红外光谱显示，3种复合材料的主要成分均为羟基磷灰石与β-磷酸三钙，并且随着煅烧骨比例的增加，复合材料中的羟基磷灰石/β-磷酸三钙的特征衍射峰逐渐增强；②扫描电镜显示，煅烧骨颗粒较均匀地分散于壳聚糖介质中；③随着煅烧骨比例的增加，复合材料的抗压强度逐渐降低；④培养7 d时，3种复合材料浸提液中的细胞生长良好，形态无明显变化；培养9 d的时间内，3种复合材料浸提液中的细胞相对增殖率均在90%以上，细胞毒性均为1级，符合生物材料的安全标准；⑤结果表明，煅烧骨/壳聚糖复合材料具备良好的结构特征、理化性能及合适的抗压强度，并且安全无毒。 关键词：
牙种植；骨增量；骨移植材料；煅烧骨；壳聚糖；羟基磷灰石；β-磷酸三钙；细胞毒性 中图分类号：R459.9；R318.08；R783.4 基金资助：
国家自然科学基金项目(81660179)，项目负责人：廖健；贵州省自然科学基金资助项目(黔科合基础[2016]1124)，项目负责人：廖健；贵州省自然科学基金联合基金项目(黔科合LH[2016]7257)，项目负责人：廖健
Preparation and characterization of calcined bone/chitosan composite material
Liao Jian1,2, Huang Xiaolin3, Zhou Qian1, Cheng Yuting1, Huo Hua1, Li Fang1, Wu Chao1, Shi Qianhui1, Liao Yunmao2, Liang Xing2 (1Guizhou Medical University School of Stomatology/Affiliated Stomatology Hospital, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; 3Department of Dental Implantation, Zhongshan City People’s Hospital, Zhongshan 528403, Guangdong Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Chitosan exhibits good physiochemical properties and biocompatibility, but it has poor biological activity of osseointegration. Therefore, it needs to combine with other materials for bone repair.
OBJECTIVE: Calcined bone/chitosan composite was prepared and its physiochemical properties and biocompatibility were analyzed.
METHODS: Calcined bone/chitosan composite was prepared at a mass ratio of 1∶2, 1∶1, 2∶1 respectively by
3452 廖健，1978年生，贵州省石阡县人，仡佬族，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要从事口腔修复与种植的基础与临床研究。
通讯作者：梁星，教授，博士生导师，四川大学华西口腔医学院，四川省成都市 610041
文献标识码:A
投稿日期：2019-12-25 送审日期：2019-12-26 采用日期：2020-02-24 在线日期：
2020-03-31
Liao Jian, MD, Associate professor, Associate chief physician, Master’s
supervisor, Guizhou Medical University School of Stomatology/Affiliated Stomatology Hospital, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Corresponding author: Liang Xing, Professor, Doctoral supervisor, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
LIAO J, HUANG XL, ZHOU Q, CHENG YT, HUO H, LI F, WU C, SHI QH, LIAO YM, LIANG X. Preparation and characterization of calcined bone/chitosan
composite material. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2020;24(22):3452-3459. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2306
solution blending method. The physicochemical properties of three composite materials were characterized. Passage 5 mouse L929 fibroblasts were treated with the leaching solution of three composite materials. The cytotoxicity of three composite materials was detected by the CCK-8 test. RESULTS AND CONCLUSION: (1) X-ray diffraction and Fourier Transform Infrared Spectroscopy showed that the essential components of three composite materials were hydroxyapatite and β-tricalcium phosphate. The characteristic diffraction peaks of hydroxyapatite/β-tricalcium phosphate increased with the increase of the proportion of calcined bone. (2) Scanning electron microscopy showed that calcined bone particles were evenly dispersed in chitosan medium. (3) With the increase of the proportion of calcined bone, the compressive strength of the composite decreased gradually. (4) After 7 days of culture, the cells in the leaching solution of three composite materials grew well without obvious change in morphology. By the ninth day, the relative proliferation rate of the cells in the leaching solution of three composite materials was over 90%.
Cytotoxicity was grade 1, which meets the safety standard of biomaterials. (5) These results suggest that the calcined bone/chitosan composite has good structural characteristics, physicochemical properties and suitable compressive strength and is safe and non-toxic
Key words: dental implant; bone augmentation; bone grafting materials; calcined bone; chitosan; hydroxyapatite; β-tricalcium phosphate; cytotoxicity
Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81660179 (to LJ); the Natural Science Foundation of Guizhou Province, No. Qiankehejichu[2016]1124 (to LJ); the Joint Fund Project of the Natural Science Foundation of Guizhou Province, No. QiankeheLH[2016]7257 (to LJ)
0 引言 Introduction
种植修复由于具有不损伤天然牙、体积小、舒适、稳定、咀嚼功能恢复好等诸多优点，目前已成为口腔临床中缺失牙的主要修复方式之一，牙种植区牙槽骨骨量不足限制了种植义齿的临床应用。骨移植技术是修复各种原因导致牙槽骨量不足的常用方法，骨移植材料从来源上分主要有自体骨、异体骨、异种骨和人工骨材料。自体骨由于具有理想的骨传导性、骨诱导性、良好的生物相容性，愈合效果好，不发生免疫排斥反应等优点[1]，已成为临床上骨缺损修复的“金标 准”，但自体骨移植存在骨量来源有限、需要额外的外科手术、供区疼痛及伤口愈合并发症等弊端[3]，在临床上的应用受到限制。异体骨移植虽然材料的来源相对广泛，但修复效果远远不如自体骨移植，且外源骨有可能传染疾病或发生免疫排斥反应的危险[4]，一直受到国际社会舆论的质疑。为了得到理想的骨移植材料，学者们已经把重心转移到人工骨替代材料的研究方面[5]，这些材料可通过沉淀[6]、水热[7]、机械化学[8]、溶胶-凝胶等方法获得[9-10]。
羟基磷灰石[化学式为Ca10(PO4)6(OH)2]是一种生物活性陶瓷，与人体自然骨和牙齿等硬组织中的无机成分和微观结构具有相似性[11]。当羟基磷灰石植入体内后，可与自然骨形成牢固的骨性结合，具有良好的生物相容性、骨引导和骨诱导作用，在硬组织置换中起到重要作用[12]，已被应用于口腔医学、整形外科及颌面外骨增量领域，尤其在种植牙科得到了广泛应用[13-14]。煅烧骨就是以羟基磷灰石为主要成分经高温锻烧处理动物骨所获得的无机材料[15]。由于高温处理使煅烧骨失去了有机相的胶原，羟基磷灰石晶体变致密、不易再吸收，其力学强度下降，脆性增加[16]，多数情况下只能作为充填材料用于拔牙窝位点保存，对于牙槽骨骨量严重不足的种植病例其应用受到限制。
壳聚糖是一类重要的带正电荷、含有游离氨基的碱性天然多糖，它在体内显示出无免疫原性、无聚集、无毒、无刺激，具有良好的生物相容性、生物可降解性，并且其产物可完全被人体吸收，很容易制备成理想大小的微球形状，所以被常用于工业和和医药中[17-18]。然而壳聚糖在自然界中很少见，并且单一组分的壳聚糖由于缺乏骨组织的无机结构，缺乏骨键合的生物活性，不能直接用于骨组织修复，所以通常用作辅助材料与其他促骨形成材料复合，
[2]
从而使两种材料达到优势互补的生物性能，更好地满足骨移植材料的要求[19]。
羟基磷灰石和壳聚糖是复合支架的基质材料，羟基磷灰石/壳聚糖复合材料作为骨组织修复材料，已有多年的研究历史。在过去对羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的研究中，无论是人工合成的羟基磷灰石与壳聚糖复合还是天然羟基磷灰石与壳聚糖复合，都已被用于骨形成的研究中[20]。在羟基磷灰石体系中，可引入壳聚糖来解决羟基磷灰石颗粒的形成和强度提高问题。在壳聚糖基质中羟基磷灰石被添加并分散在壳聚糖基质中，以改善羟基磷灰石/壳聚糖材料与骨组织之间的骨结合[21]。GE等[22]采用溶液共混法制备不同质量比例(羟基磷灰石/壳聚糖=1/2、1/1、2/1)的羟基磷灰石/壳聚糖复合材料，经过体外细胞毒性实验、体外细胞生物相容性实验及兔体内降解和模拟骨缺损修复实验得出，羟基磷灰石/壳聚糖复合材料安全无毒、生物相容性好、体内可降解、可促进骨组织钙化。ITOH等[23]将溶液共混法制备的羟基磷灰石/壳聚糖复合材料用于神经再生修复，结果表明壳聚糖/羟基磷灰石复合材料有助于神经组织修复。Lü等[24]采用交联的方法制备天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料，通过理化性能检测、体外细胞相容性及动物体内实验证实：天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料具备很好的硬组织生物相容性及优越的骨传导性。RUIXIN等[12]研究表明随着培养时间的延长，细胞活性显著提高。随着降解时间的延长，羟基磷灰石/壳聚糖支架结构逐渐破坏而羟基磷灰石粒子的无机成分越来越多，是一种很有潜力的骨修复材料。然而，有关煅烧骨与壳聚糖复合后的理化性能研究目前报道很少。实验将壳聚糖与煅烧骨按不同质量比进行复合，研究此复合材料的理化性能，为其引入临床修复骨缺损提供理论依据。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 细胞形态学观察实验。
1.2 时间及地点 实验于2017年1月至2018年9月在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室完成。
1.3 材料 煅烧骨粉由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室生物材料中心廖运茂研究员提供，Bio-oss骨粉(Geistlich，Switzerland)由贵州医科大学附属口腔医院修复种植科提供，将样本经过超声清洗、震荡、烘干后，取
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廖健，黄晓林，周倩，程余婷，霍花，李芳，伍超，石前会，廖运茂，梁星. 煅烧骨/壳聚糖复合材料的制备及表征[J]. 中国组织工程研究，2020，24(22):3452-3459. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2306
少量用于扫描电镜观察，称量2 g用于压汞法检测，称取2 g颗粒研磨成粉末，1 g用于X衍射分析，另1 g粉末用于傅里叶变换红外线光谱分析检测；壳聚糖(脱乙酰度95%，浙江金壳生物化学有限公司，表1)。 表 1 壳聚糖材料介绍 Table 1 Introduction of chitosan material
项目
壳聚糖
生产厂家 浙江金壳生物化学有限公司 批号
D120221022 脱乙酰度
95% Mw
150 000
医学用途 合成药物，制备生物制剂 生物相容性
医药级
实验用主要试剂与仪器：胎牛血清(Gibco，USA)；DMEM培养基(Hyclone，USA)；乙醇、乙酸(成都市科龙化工试剂厂)；X射线衍射仪(X’Pert Pro MPD， Philips，Dutch)；Inspect-F型扫描电子显微镜(FEI，USA)；傅里叶变换红外线光谱分析仪(Thermo Scientific， USA)；全自动压汞仪(MIP，AutoPore IV 9500，Micromeritics instrument corporation)；万能材料试验机(AG10TA，JEOL，Japan)；倒置相差显微镜(Olympus，Japan)。 1.4 实验方法
1.4.1 复合材料的制备 采用溶液共混法制备复合材料。步骤如下：①称取一定量的壳聚糖粉末，加入到质量分数为2%的乙酸溶液中，配成质量分数为4%的壳聚糖溶液，置于恒温水浴锅中70 ℃搅拌1 h；②称取一定量的煅烧骨粉末，在少量的蒸馏水中超声分散20 min，制成粉浆；③按照煅烧骨/壳聚糖质量比为1/2、1/1、2/1的比例分别将粉浆缓慢加入到壳聚糖溶液中；④用氨水调节溶液的pH值使其维持在5左右，继续搅拌，使溶液蒸发后便得到黏稠状的复合物；⑤将具有一定流动性的复合物注入到模具(50 mm×50 mm× 1 mm)中成膜，注入到直径为10 mm、高20 mm的模具中成圆柱状试件；⑥将模具放入60 ℃的真空烤箱(0.9真空度)内干燥；⑦将干燥的试件用1 mol/L的NaOH溶液浸泡，去除残留乙酸；⑧用双蒸水漂洗试件，在60 ℃烤箱中烘干即可得到预制形状的煅烧骨/壳聚糖复合材料。
1.4.2 X射线衍射分析 采用X射线衍射仪对煅烧骨、Bio-oss骨粉及不同质量比例的煅烧骨/壳聚糖复合材料分别进行物相组成分析，分析条件为：电压35 kV，电流 25 mA，衍射起始角10°，衍射终止角80°，步宽0.06°，波长1.540 6 nm。
1.4.3 扫描电镜观察 将煅烧骨、Bio-oss骨粉及不同质量比例的煅烧骨/壳聚糖复合材料样品烘干后真空喷金，采用扫描电镜扫描样品表面，观察样品的超微空间结构及材料表面特点(孔径大小、孔隙连接等)，记录并照相。 1.4.4 傅里叶红外光谱分析 采用傅里叶变换红外线光谱分析仪在400-4 000 cm-1光谱下对对煅烧骨、Bio-oss骨粉及不同质量比例的煅烧骨/壳聚糖复合材料进行成分分析。 1.4.5 全自动压汞仪测量 用压汞法测量分析煅烧骨大
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孔和微孔的总孔容、总孔隙率、比表面积、平均孔径、孔径分布等参数。
1.4.6 复合材料的力学性能测试 使用万能材料试验机对不同质量比的煅烧骨/壳聚糖复合材料进行抗压强度测试。于室温和60%相对湿度下将标本牢靠固定, 以2 mm/min的速度等速加载压缩，直至标本破裂或者厚度减少60%。按照公式计算抗压强度[25]，抗压强度(MPa)=4Fmax÷(πd2)，其中Fmax为最大加载力(kg)，d为试件的直径(mm)。每种样品测6次，取平均值。
1.4.7 复合材料浸提液的制备 将不同比例的煅烧骨/壳聚糖复合材料先用体积分数75%乙醇浸泡2 h，再用灭菌的PBS反复冲洗，干燥后在密闭的环境中采用紫外灯双面照射灭菌30 min，密封包装后备用。使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基作为浸提介质，按照复合材料/浸提介质=1 g/10 mL的比例将复合材料放入培养基中浸泡，置于体积分数5%CO2饱和度、37 ℃的培养箱中72 h备用。 1.4.8 小鼠成纤维细胞L929的培养及形态学观察 将L929细胞株(由口腔疾病研究国家重点实验室提供)从-196 ℃液氮罐中取出后立即投入到39-41 ℃的水中，迅速摇动使冻存的细胞溶解，再将冻存管放入到高速离心机内1 000 r/min离心8 min，然后吸去上清液，加入pH=7.2、含体积分数10%胎牛血清、50 U/mL青霉素/链霉素的低糖型DMEM培养基1 mL，混合均匀后再将L929细胞混合液吸入到培养瓶中，补充5.0-6.0 mL相同的DMEM培养基，将培养瓶放入体积分数5%CO2饱和度、37 ℃的培养箱中培养，48 h换液。
待细胞生长达80%左右融合后倒掉培养基，PBS轻柔清洗3次，将0.25%胰蛋白酶0.5 mL加入到培养瓶中，轻轻均匀晃动培养瓶，使胰酶完全浸没培养瓶底的细胞，在37 ℃培养箱中放置3 min后取出，使用倒置相差显微镜观察细胞消化情况，当发现细胞皱缩变圆并开始与培养瓶底分离时，随即用巴氏吸管吸掉胰酶并加入DMEM培养基终止消化，用巴氏吸管反复吹打瓶底使贴壁的细胞完全脱落，按1×104细胞浓度传代，根据细胞的生长情况每两三天更换一次培养基，重复以上操作，当细胞传至5代后待用。采用倒置相差显微镜观察细胞的形态和生长变化情况，在每个时间点终止培养前1 h拍照记录。
1.4.9 细胞毒性测定 取第5代L929细胞，按细胞密度1×104接种到96孔板，每孔加入含体积分数10%胎牛血清、
50 U/mL青霉素/链霉素的低糖型DMEM培养基0.1 mL，培养1 d后更换不含胎牛血清的DMEM培养基0.1 mL，继续培养1 d根据实验分组更换不同的培养基。实验共分为4组：A组更换为煅烧骨/壳聚糖=1/2复合材料的浸提液，B组更换为煅烧骨/壳聚糖=1/1复合材料的浸提液，C组更换为煅烧骨/壳聚糖=2/1复合材料的浸提液，D组(阴性对照)更换为单纯的DMEM细胞培养液，每组设6个复孔。设定5个检测时间点(1，3，5，7，9 d)，后3个时间点(5，7，9 d)根据细胞生长情况可以更换1-3次培养基。为了避免检测吸光度时细胞污染，在每个时间点各使用1个96孔细胞培养板，
LIAO J, HUANG XL, ZHOU Q, CHENG YT, HUO H, LI F, WU C, SHI QH, LIAO YM, LIANG X. Preparation and characterization of calcined bone/chitosan
composite material. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2020;24(22):3452-3459. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2306
共计5个培养板。在每个时间点测吸光度前吸去每孔原培养基，更换新鲜培养基的同时在每孔加入10 μL的CCK-8试剂，放入体积分数5%CO2饱和度、37 ℃培养箱中继续培养1 h后，立即用酶联免疫检测仪在450 nm波长下测定每孔的吸光度。计算6个孔板的平均值作为最终的结果，描记增殖曲线，计算细胞相对增殖：细胞相对增殖率(%)=实验组吸光度值÷阴性对照组吸光度值×100%。
计算出细胞的相对增殖率后，按照GB/T16175-1996标准参考的标准来评定材料细胞毒性等级[26]，见表2。
表2 Table 2
细胞相对增殖率与细胞毒性对照表
Relative cell proliferation rate and cytotoxicity 细胞相对增殖率 细胞毒性 材料的生物相容性 ≥100%
0级 合格 75%-99%
1级 合格
50%-74% 2级 结合细胞形态分析 25%-99%
3级 不合格 1%-24% 4级 不合格 0%
5级
不合格
1.5 主要观察指标 ①煅烧骨及Bio-oss骨粉的物相组成；②煅烧骨/壳聚糖复合材料的超微空间结构、材料表面特点和成分；③煅烧骨大孔和微孔的总孔容、总孔隙率、比表面积、平均孔径、孔径分布等参数；④煅烧骨/壳聚糖复合材料的细胞毒性。
1.6 统计学分析 利用SPSS 17.0软件包对数据进行统计分析，两组之间的比较用t 检验，多组之间的比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，取P < 0.05表示差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 X射线衍射分析结果 从图1中可见，煅烧骨中既含有羟基磷灰石的特征衍射峰(2θ=32.1°的主峰和33°的次强峰等)又具有β-磷酸三钙的特征峰(2θ=31°的主峰和33.2°的次强峰)，煅烧骨与标准的羟基磷灰石/β-磷酸钙峰吻合。X射线衍射定量分析结果表明，两种成分之间的质量比为羟基磷灰石/β-磷酸钙=60/40。
从图2中可见，Bio-oss中既含有羟基磷灰石的特征衍射峰(2θ=32.1°的主峰和33°的次强峰)又具有β-磷酸三钙的特征峰(2θ=31°的主峰和33.2°的次强峰)，与标准的羟基磷灰石特征峰基本吻合，说明Bio-oss的成分主要是羟基磷灰石。
从图3可以看出，在2θ=20.2°处的衍射峰为壳聚糖特征峰，由于壳聚糖是非晶态，故为弥散的宽峰；在2θ=32.1°和33°属于羟基磷灰石的特征衍射峰；在2θ=31°和33.2°属于β-磷酸三钙的特征峰。可以认为采用溶液共混法制备的煅烧骨/壳聚糖复合材料组成成分没有发生变化，保留了煅烧骨和壳聚糖的物质特性；从图3中还可以发现随着煅烧骨质量比的不断增加，羟基磷灰石/β-磷酸三钙的特征衍射峰增强。 2.2 扫描电镜观察结果 从图4可见，煅烧骨粉颗粒直径在1.2-1.5 mm，颗粒拥有大小相互贯通的孔隙，孔隙由直径为1-300 μm的孔所组成，在较大孔壁上还分散着许多较
小的微孔，而Bio-oss骨粉颗粒内部孔隙较少。
图5显示了不同质量比例煅烧骨/壳聚糖复合材料在低倍和高倍下的扫描电镜图，从图中可见煅烧骨颗粒比较均匀地分散在壳聚糖介质中。
2.3 傅里叶红外光谱分析结果 通过红外光谱图上谱带显示的吸收峰位置、宽度及强度等参数对比纯羟基磷灰石和β-磷酸三钙标准图谱后发现，煅烧骨粉主要由羟基磷灰石和β-磷酸三钙组成，见图6。
图7分别列出了壳聚糖、煅烧骨及不同质量比例煅烧 骨/壳聚糖复合材料的红外光谱图，由图中可以发现，复合材料中仍然包含了壳聚糖和煅烧骨(羟基磷灰石/β-磷酸三钙)的特征峰，表明材料经过复合后并没有改变原材料的化学成分。随着煅烧骨成分的增加，属于羟基磷灰石和β-磷酸三钙的特征峰(1 048.6，605.3，569.6 cm-1)强度逐渐增加，壳聚糖特征峰(3 431.7，1 605 cm-1)则逐渐减弱，但是基本上没有发生位移，说明煅烧骨和壳聚糖之间属于物理结合，并没有发生化学键的结合。
2.4 压汞法检测结果 通过压汞法测得该煅烧骨粉的孔隙率为85%，具有0.841 3 mL/g的总孔容和6.827 m2/g的比表面积，该煅烧骨粉的孔径范围为0.01-350 μm。从图8中可以看出，2个主峰分别位于0.5 μm和250 μm(红色箭头)，在所有孔隙中，以0.1-2.0 μm直径的微孔和100-350 μm的大孔为主。另外，还有部分10-90 μm直径的小孔(蓝色三角形指示)。结果表明：该煅烧骨主要由0.1-2.0 μm直径的孔和100-350 μm的孔所组成，这也与扫描电镜结果吻合，进一步证明在较大孔壁上(100-350 μm)分散着大量较小的微孔(0.1-2.0 μm)。
2.5 抗压强度检测结果 从表3中可以看出，复合材料的最大抗压强度达到89.3M Pa，最小强度为22.3 MPa，随着煅烧骨粉成分的增加，抗压强度呈下降趋势。
表3 各种比例煅烧骨/壳聚糖复合材料的抗压强度 (n=6) Table 3
Compressive strength of different ratios of calcined bone/chitosan composite
煅烧骨 /壳聚糖 最大加载力(x_
±s，kg) 抗压强度(MPa) 1/2 701±45 89.3 1/1 467±38 59.8 2/1
175±19
22.3
2.6 L929细胞的形态学观察结果 从图9中可以观察到，细胞在3种不同比例的复合材料浸提液中生长良好，与阴性对照组没有差别，说明复合材料对细胞的生长没有影响。 2.7 材料对L929的细胞毒性 细胞在各组浸提液中生长良好，随着培养时间的增加，各组细胞的量也不断增多。从表4中可以看出，细胞在第1-7天增殖较快，其中第1-3天增长最快，从第7天开始增长速度变慢，进入平台期，4组组内5个时间段的细胞增殖比较差异有显著性意义(P < 0.05)，相同时间点下各实验组与阴性对照组间的细胞增殖比较差异无显著性意义(P > 0.05)。各复合材料组的细胞相对增殖率为94.2%-98.5%，对应的细胞毒性为1级，见表5，符合生物材料安全级别要求。
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廖健，黄晓林，周倩，程余婷，霍花，李芳，伍超，石前会，廖运茂，梁星. 煅烧骨/壳聚糖复合材料的制备及表征[J]. 中国组织工程研究，2020，24(22):3452-3459. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2306
各组L929细胞不同时间点的吸光度值 (x±s) 表4 _
表征结果表明，煅烧骨由羟基磷灰石和β-磷酸三钙组成，因Table 4 Absorbance values of L929 cells at different time points in each group
组别 1 d
3 d
5 d
7 d
9 d
A组 0.217±0.009 0.934±0.013 1.314±0.019 1.624±0.033 1.734±0.077 B组
0.215±0.006 0.916±0.011 1.312±0.024 1.618±0.025 1.726±0.056 C组 0.212±0.005 0.909±0.014 1.306±0.027 1.609±0.019 1.718±0.017 D组 0.225±0.002 0.948±0.021 1.357±0.035 1.655±0.027 1.803±0.044
表注：A-C组使用的培养液分别为煅烧骨/壳聚糖=1/2，1/1，2/1复合材料的浸
提液；
D组为应用细胞培养液的阴性对照；相同时间点下，A、B、C组的吸光度值与
D组比较差异无显著性意义(P > 0.05)
表5 不同比例煅烧骨/壳聚糖复合材料的毒性分级
Table 5 Toxicity grading of different ratios of calcined bone/chitosan composite materials 时间 煅烧骨/壳聚糖=1/2 煅烧骨/壳聚糖=1/1 煅烧骨/壳聚糖=2/1 细胞相对毒性分级 细胞相对毒性分级 细胞相对毒性分级
增殖率 增殖率 增殖率
1 d 96.40% 1 95.50% 1 94.20% 1 3 d 98.50% 1 96.60% 1 95.90% 1 5 d 96.80% 1 96.60% 1 96.20% 1 7 d 98.10% 1 97.70% 1 97.20% 1 9 d 96.10% 1 95.70% 1 95.20% 1
3 讨论 Discussion
实验通过X射线衍射和傅里叶红外光谱析发现，Bio-oss骨粉的特征峰与标准的羟基磷灰石特征峰基本吻合，说明Bio-oss骨粉的成分主要是羟基磷灰石。而煅烧骨的特征峰与标准的羟基磷灰石/β-磷酸三钙峰吻合，说明煅烧骨的主要成分除了含有羟基磷灰石，还含有β-磷酸三钙，很少含有其他物质成分，这与HEIDARI等[14]的研究结果一致。羟基磷灰石主要用于种植体表面涂层或作为牙槽骨骨增量的骨移植材料。羟基磷灰石因为一些缺陷，比如纯的羟基磷灰石降解慢、强度低，在骨移植中不合适单独使用。β-磷酸三钙的微观结构为三斜晶体，虽然它的力学强度弱于羟基磷灰石，但是其降解速度较羟基磷灰石快得多。JIANG等[27]认为超高孔隙的β-磷酸三钙孔隙率可以达到90%，孔径为1-1 000 μm，这种结构有利于细胞长入和液体的弥散，降解速度也更接近成骨的速度，是一种较好的可用于骨折和骨缺损修复的骨植入材料。王诗美等[28]将三维结构相同、孔隙率均为75%的羟基磷灰石/β-磷酸三钙和羟基磷灰石材料分别植入兔股骨骸部，研究两种材料的降(溶)解与新骨形成的匹配性，组织学结果发现：多孔的羟基磷灰石/β-磷酸三钙的降解明显快于多孔羟基磷灰石，6个月后β-磷酸三钙已降解断裂为片段状并被新骨组织所包裹，而且新骨已分化成熟为板层骨，羟基磷灰石则降解极其缓慢，同期仍保留材料的多孔结构。β-磷酸三钙的降解机制是体液和细胞介导的降解，而在β-磷酸三钙的生物吸收中破骨细胞起到了重要作用，因此β-磷酸三钙的吸收对骨形成有重要作用。多孔β-磷酸三钙陶瓷作为骨填充和骨替换材料已被广泛应用于口腔临床。作为骨缺损提供临时支架时，多孔β-磷酸三钙陶瓷能引导自体骨组织再生，使骨缺损区形成新的有生命的有机物。X射线衍射和傅里叶红外光谱
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此可以预知它的降解性能介于羟基磷灰石和β-磷酸三钙之间，可以克服羟基磷灰石过于稳定、β-磷酸三钙降解过快等降解速率不能与新生组织生长速率相匹配的缺点。
骨移植材料的孔隙结构对提高材料的生物相容性及生物活性至关重要[29]。实验采用“压汞法”来测量材料的孔隙情况，使用的仪器为AutoPoreⅣ9500压汞仪，该仪器自动化程度高，使用非常方便，常常用于研究材料的孔隙大小及分布、总孔隙容积、总孔隙面积等物理性能，是研究多孔材料中主要的表征手段。骨移植材料的孔隙结构主要包括孔径大小、孔径交通及孔隙率等，孔隙结构会决定骨增量过程中细胞是否长入或长入的速度，其中孔隙率是骨移植材料的一个重要参数。孔隙之间相互贯通并拥有较高孔隙率的材料，具有具备较大的比表面积，可以增加成骨样细胞的黏附空间，让细胞更容易长入材料的孔隙中，有利于细胞养分和代谢产物的运输及物质交换，为细胞黏附生长提供载体，促进细胞的增殖和分化，更容易促进骨愈合。但是孔隙率太高会降低材料的力学强度，过少的孔隙率又会妨碍细胞长入材料，从而影响骨愈合。到底多少的孔隙率作为骨移植材料的标准目前尚无定论。WANG等[30]研究证实人体骨小梁的孔隙率范围在30%-90%，有人认为骨移植材料的孔隙率应大于40%。同时，在材料的适合的孔径大小方面也有许多学者做出了大量研究，马东洋等[31]研究认为理想的支架材料孔径大小为300-400 μm，孔隙率在80%以上为宜；HOLLINGER等[32]认为骨移植材料大于100 μm利于细胞向微孔生长，大于200 μm促进骨单位形成；LU等[33]认为材料的孔径在40-400 μm有利于骨组织形成；PE?A等[34]通过研究认为孔径在300 μm以上促进血管的形成；JIN等[29]认为材料孔径在100-350 μm之间有利于骨组织的生长，更小级别的纳米和微米孔能够增强蛋白黏附于材料表面。此次实验扫描观察发现，煅烧骨为类似于人骨的天然多孔网状结构，煅烧骨颗粒内拥有大小相互贯通的孔隙，孔隙的直径主要集中在0.1-350 μm之间，在较大孔壁上还分散着许多较小的微孔。经全自动压汞仪测定煅烧骨的总孔隙率为85%，满足骨移植材料的要求。
根据原材料来源，羟基磷灰石可以分为人工合成和天然来源2种。人工合成羟基磷灰石大部分的制备方法费时、制作的成本高。而羟基磷灰石是动物的骨骼和牙齿的主要无机成分，因此在自然界中即存在大量的羟基磷灰石原材料。采用不同的方法可以从天然骨中制备羟基磷灰石，如热处理煅烧、碱性水解和亚临界水法[35-36]。此次实验通过热煅烧方法得到以羟基磷灰石为主要成分的煅烧骨，其保留了天然骨的孔隙率、孔径大小、孔隙贯通等结构特点，而且制作成本低、方法简单。在中国，牛肉是食品中肉类的主要来源之一，而且每天消耗牛肉后遗留下来的废弃物牛骨的量是巨大的，如果能将这些废弃的食品垃圾充分利用起来，制备成天然的骨移植材料(煅烧骨)，应用到种植牙科、骨科及整形外科的临床工作中，无疑是非常有效和环保的，同时也满足目前社会倡导的“节约环保”的主题要求。例如，
煅烧骨壳聚糖复合材料的制备及表征 - 图文
