目录
1 材料与方法.....................................................................................................................................1
1.1菌株的保存与培养...............................................................................................................1 1.2 培养基的配制 ......................................................................................................................1 1.3 质粒转化酵母 ......................................................................................................................2 1.4 对二糖利用能力 ..................................................................................................................3 1.5 TTC显色 ..............................................................................................................................3
2 结果与分析.....................................................................................................................................3
2.1 对二糖利用能力 ..................................................................................................................3 2.2 TTC显色 ..............................................................................................................................4 附录.....................................................................................................................................................5
1．材料与方法
1.1 菌株的保存与培养 1.1.1 实验用酵母菌株
实验中所用到的YTK12酵母菌株由本公司保存，菌株于YPDA培养液摇菌后保存成30%
的甘油菌于-80℃冷冻保存。YTK12于28℃培养箱中培养。 1.2 培养基的配制
YPDA 酵母提取物 蛋白胨 葡萄糖
10 g/L 20 g/L 20 g/L 0.03 g/L
硫酸腺嘌呤
加水溶解，定容至1 L，固体培养基加入20 g/L琼脂，121℃灭菌15 min。 2×YPDA 酵母提取物 蛋白胨 葡萄糖
20 g/L 40 g/L 40 g/L 0.03 g/L
硫酸腺嘌呤
加水溶解，定容至1 L，固体培养基加入20 g/L琼脂，121℃灭菌15 min。 CMD-W 酵母氮源
6.7 g/L 0.75 g/L 20 g/L 1 g/L
-Trp Dropout 蔗糖
葡萄糖
加水溶解，调节pH至5.8，定容至1 L，固体培养基加入20 g/L琼脂，121℃灭菌15 min。 YPRAA 酵母提取物 蛋白胨
10 g/L 20 g/L
1
棉子糖 20 g/L
加水溶解，调节pH至5.8，定容至1 L，固体培养基加入20 g/L琼脂，121℃灭菌15 min。培养基温度降至50-60℃，超净台内加入2 mL Antimycin A（1 mg/mL）混匀，倒板备用。 1.3 质粒转化酵母
按下表将以下质粒转入酵母YTK12菌株中：
表1 所需转化的质粒
Reaction 1 2 3
plasmid pSUC2 pSUC2-52-JJP pSUC2-Avr1b
涂板种类 SD-Trp SD-Trp SD-Trp
备注 阴性对照 实验组 阳性对照
1） 从YPDA平板挑取YTK12单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5；
2） 转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6；
3） 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min；
4） 用20 mL无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清； 5） 用5 mL 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清； 6） 用500 μL 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 mL离心管，每个50 μL（每个转化），备用；
7） 每个1.5 mL离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀；
表2 酵母转化体系各组分及用量
50%PEG3350
240 μL
1 M LiAc 36 μL
ssDNA (20 mg/ml)
5 μL
质粒 各5 μL
8） 30℃水浴孵育，30 min；
2
9） 42℃水浴热激，25 min。
10） 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清；
11） 加入3 mL 2×YPDA，尽量温和地悬浮菌体，30℃，225 rpm，振荡培养1 h； 12） 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清；
13） 每个转化用200 μL无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布CMD-W筛选平板。 1.4 对二糖利用能力
1） 上述平板中，分别随机挑取6个克隆，用SUC2-F/R引物进行PCR验证，全部为正确克隆；
2） 从中选择1个克隆划线到YPRAA平板上，通过观察酵母菌对棉子糖的利用情况来验证信号肽的功能；
3） 同时，将转化子划线到CMD-W平板上作为对照。 1.5 TTC显色
1） 从CMD-W平板挑取单菌种接于液体CMD-W培养基5 mL，30℃，225 rpm，振荡培养24 h；
2） 室温，13000 rpm离心5 min收集菌体；
3） 弃上清，加入1 mL无菌水重悬沉淀，室温，13000 rpm离心5 min收集菌体； 4） 重复步骤3一次；
5） 加入1 mL蔗糖溶液，重悬菌体；
6） 加入1%TTC溶液，35℃水浴30 min，室温放置5 min，观察颜色变化并拍照。
2．结果与分析
2.1 对二糖利用能力
本研究采用pSUC2酵母分泌系统来进行验证，Avr1b的信号肽已经被证明具有分泌功能，
将其信号肽融合至pSUC2的N端，构建pSUC2-Avr1b重组载体作为阳性对照，pSUC2空载体作为阴性对照。另外分别构建pSUC2-X信号肽重组载体，转入酵母菌株YTK12。实验结果表明，阴性对照pSUC2在YPRAA平板上不能生长，而转入pSUC2-X信号肽的酵母可以在YPRAA培养基上生长，结果与阳性对照pSUC2-Avr1b一致，说明该基因的信号肽具有分泌功能（图1）。
3
图1 对二糖利用能力
实验组pSUC2-X信号肽、阴性对照pSUC2与YTK12菌株、阳性对照pSUC2-Avr1b在CMD-W和YPRAA平板上的生长情况。
2.2 TTC显色
由图2可知，携带pSUC2-X信号肽和pSUC2-Avr1b的酵母菌株YTK12分泌蔗糖酶能把
蔗糖水解成单糖，单糖与TTC反应产生红色不溶于水的氯化三苯基四氮唑。YTK12和携带pSUC2的酵母菌株YTK12不分泌蔗糖酶，因此不能与TTC发生显色反应。
图2 TTC显色
实验组pSUC2-X信号肽、阴性对照pSUC2与YTK12菌株、阳性对照pSUC2-Avr1b TTC显色情况。
4
附录
表1 本实验所用的引物 引物名称 SUC2-F SUC2-R 序列（5’-3’） CGTCATTGTTCTCGTTCCCT GTGAAGTGGACCAAAGGTCT 应用 菌落PCR 菌落PCR
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酵母信号肽检测结果展示
