7）12000转离心1min，弃滤液。
8）加入500ul溶液PB（洗涤液）12000转离心1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒
DNA。
9）加入500ul溶液W（去盐液），12000转离心1min，弃滤液，重复一次。10）12000转离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。11）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加PH为），室温放置
2min。
DNA，质粒于-20℃保存。
50-100ul溶液Eluent（为无菌的双蒸水，
12）12000转离心1min，此时管底即为高纯度的质粒
质粒提取步骤：吸取液体培养基于离心管中留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于250ulBufferS2
温和充分的上下翻转
12000转离心1min，弃上清，吸取培养基重复离心弃上清离心，-20℃——加
250ulBufferS1
悬浮细菌，悬浮均匀——加350ulBufferS3
温和上下翻转
4-6次混合均匀，使菌体裂解——加
12000离心10min——取上清液转移到专用的制备管（2ml）12000转离心500ulBufferW112000转离心1min，弃滤液——加—将制备管置回
1min，弃滤液——加
500ulBufferW212000转离心1min，弃滤液，重复一遍—
60~80ulEluent
或离子
2ml离心管12000转离心1min——将制备管移入新的离心管中，加
水，室温1min12000转离心1min——移去制备管，将有质粒的离心管于4℃或是-20℃保存
4、质粒DNA和其他包装质粒共转染
名词解释
293T细胞产生病毒（即病毒包装）
细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系过表达各种目标蛋白
, 或是用以包装病毒。
, 被广泛应用于瞬时转染以
4.1.2脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。共转染的操作步骤第一天：用无抗生素80%-90%融合度第二天：1. 500ul 2. 500ul
无血清培养基稀释无血清培养基稀释
2ug 表达质粒+ psPAX2+ 15ul 脂质体2000
20min
1ml质粒和脂质体混合物。
DMED+10?（从此
DMEM+10?S铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到
3. 5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止4. 从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入5. 6-10h后，移除含有刻开始算时间）。第三天：
1.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到第四天：
1.转染后48和72h分别收获含病毒的上清。 rpm 离心20min，滤膜过滤，去除细胞沉淀。转离心浓缩细胞、分装
-80°C贮存。
DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液
70%以上
4.滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。病毒包装的原理
质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜，
（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的
psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达
lipofectamine2000
为慢病毒的膜蛋白质粒，通过
进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。
在上述程序中提及的
“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入
细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到靶细胞的基因组中，因为质粒DNA只能转录出病毒
完成转染过程，
RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，
故对宿主细胞是无害的并且高效的将
因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，目的基因转然到靶细胞基因组中。
5、慢病毒感染细胞
流程图
感染步骤
1）铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按2）感染：将
1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜
PBS浓度梯
70-80%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入
度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。
3) 24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。荧光显微镜的操作流程
打开荧光器（30min内不能关闭，否则影响显微镜寿命）
，细胞培养板置于载物台，调
节物镜和光圈，先用自然光观察视野内细胞，再关闭光，开启荧光通道，观察荧光强度，判定感染率。图片取样前可以调节曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美。
（针对leica注意事项内容
1.病毒浓度要适宜，太少的话细胞被感染的也少，但是病毒浓度太大，对细胞有伤害。
2.感染病毒时培养基量少，以保证病毒的浓度，在培养10h左右可根据培养基颜色加培养基。3.在不明确细胞感染复数情况下，可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数。4.在加病毒后一般
24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体时间根据细胞状态来看。
）
6、感染后的细胞检测方法
荧光初步检测
若有荧光，则表示病毒感染成功，
但并不能确定目的基因是否整合到细胞中，
待进一步
检测，荧光有强弱之分，与病毒加入的量有关。的提取及RT-PCR检测6.2.1原理
因为真核细胞
DNA含有很多非编码区，真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和
mRNA，，是否表达真核生物的基因并表达相应的
拼接，去掉这些非编码区，才能形成真正的蛋白，只能通过提取其6.2.2RNA提取步骤
加1mlTrizol
mRNA并RT-PCR这条途径来测定
，吹打后移至无菌的离心管中；加100ul氯仿剧烈振荡30s混匀，12000
转15min，可看到明显分层；取上层透明液体至新的离心管中，加等体积的异丙醇，混匀静置10min，12000转离心10min，弃上清，加风干剩余液体，最后加6.2.3RT-PCR步骤：RT是一个逆转录的过程，
用前一天提取好的总
RNA，在加入引物，模版和酶，
并在PCR仪的
1ml70%乙醇，12000转，离心10min，弃上清，
RNA纯度。
DEPC-水溶解RNA，电泳，粗步判定
温度设置下，RNA可逆转录为cDNA。
PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下进行复制成双链蛋白提取及Western检测
western-Bloting
：蛋白免疫印迹（Western blotting
或 Immunoblotting
）一般由凝
DNA。（具体步骤省略）
胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。质转移到一种固相支持物上，转移的方法多用电泳转移
SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，第二步把凝胶中已分成条带的蛋白
(NC 膜)和 PVDF 膜，蛋白
用得最多的材料是硝酸纤维素膜
（转移电泳），它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第
免疫检测的方法可以
再
三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（
在用特异性的第一抗体杂交结合后，
AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）
杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。
X 光底片上暴光的条带来显示抗原的
病毒包装实验整体流程及原理
