一.分子生物学的概念: 任何一个蛋白质分子，在其天然状态或活性形式下，都具有特定的基本结构和独特而稳定的空间构象，这是蛋白质分子在结构上的一个最显著的特征。
? 我们要研究蛋白质的功能，就必需要研究蛋白质的结构，不仅要研究其一级结构，还要了解其空间构象，这样才能全面而深入的阐明蛋白质结构与功能的相互关系。 （一）活性蛋白质与前体
? 许多活性蛋白质都有一个不具有生物活性的前体，需经专一性蛋白酶的限制性水解，切去一个或几个肽段，才能转变成有活性的蛋白质。
? 许多激素，如：胰岛素、甲状腺素、生长激素和胰高血糖素等均存在激素前体。 ? 另有多种蛋白水解酶和凝血酶也都是由其前体—酶原转变而来。 ? 前体蛋白均无生物活性。 胰岛素前体及其激活
? 人的胰岛素最初由胰腺细胞合成时，是一条由110个氨基酸残基组成的前胰岛素原肽链；
? 其N端有一个约24个氨基酸残基组成的信号肽，富含疏水氨基酸，因此可穿过内质网膜，将新生肽链输送到内质网腔，经内质网膜上的信号肽酶作用，剪去信号肽序列，形成胰岛素原（proinsulin)
? 胰岛素原是一条有86个氨基酸残基组成的多肽链，B 链在前，A 链在后，C 链〈连接肽〉插在中间
? 当胰岛素原在高尔基体包装并分泌时，A 、B 链间的 C 链才被切除，生成由A链与B链组成的具有生物活性的胰岛素。 胰岛素前体的激活
这种Hb分子的一级结构的微小改变，使原来处于分子表面的含有可解离基团侧链的谷氨酸被具有疏水性侧链的缬氨酸取代，从而使HbS的β亚基表面形成局部疏水区，称为粘斑。
?这种Hbs在氧分压低的情况下进行线形缔合，形成纤维状沉淀，导致Hb与氧的亲和力降低，并使RBC被扭曲成镰刀状，可塑性下降，容易破裂溶血—贫血。
二、蛋白质的空间结构与功能 （三）结构域:
? 在一些相当大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成在三维空间上明显区别的局部区域，称为结构域。 ? 结构域一般由100～200个氨基酸残基组成，具有独特的空间结构，并具有不同的生物学功能。
? 较大的蛋白质分子可含有两个或多个结构域，如木瓜蛋白酶含有2个结构域；IgG含有12个结构域。
? 一个蛋白质分子中的几个结构域有的是相同的，如硫氰酸酶的2个结构域是相同的；有的则是不同的，如木瓜蛋白酶的2个结构域不相同。
? 不同蛋白质中也可有相似的结构域，如LDH和苹果酸脱氢酶都以NAD+为辅酶，都由2个不同的结构域组成，其中与NAD+结合的结构域是基本相同的。
（五）蛋白质的三级结构:
? 是指一条多肽链中所有原子的空间排布，这条多肽链可以是完整的蛋白质分子，也可以是多亚基蛋白质的亚基。
? 也可以说，具有二级结构、超二级结构或结构域的一条多肽链，由于顺序上相隔较远的氨基酸残基侧链的相互作用，而进行范围广泛的盘曲和折叠，形成包括主、侧链在内的空间排布。
? 这种由一条多肽链所形成的三维空间的整体排布称为三级结构。 （六）模序（模体motif）
? 随着蛋白质三级结构研究的进展，在许多蛋白质分子中，可发现2个或3个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成立体形状或拓扑结构颇为类似的，具有特殊功能的局部区域，被称为模序。 ? 每个模序都有特征性的氨基酸序列，并发挥特殊功能。
? 如：钙结合模序、锌指模序、亮氨酸拉链。都具有结合DNA的功能。 （七）蛋白质的四级结构:
? 许多蛋白质分子作为一个活性单位时，是由两条以上的多肽链组成，这些多肽链都有各自的三级结构，称为蛋白质分子的亚基。 ? 有二个或二个以上亚基借非共价键聚合在一起就形成蛋白质的四级结构。 ? 分子量在55000以上的蛋白质几乎都有亚基。
?亚基虽然具有三级结构，但单独存在时均无生物活性，只有聚合成完整的四级结构才具有生物活性。 （八）蛋白质空间结构的折叠
? 蛋白质翻译的产物多肽链必须正确的折叠才能形成具有天然构象的蛋白质。
? 新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成，新生肽链N-端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模序、结构域到形成完整空间构象。
?几种有促进蛋白质折叠功能的大分子:
分子伴侣: （ molecular chaperon分子伴侣是细胞内一类可识别肽链的非天然构象、促进各功能域和整体蛋白质正确折叠成天然构象的保守性蛋白质。
热休克蛋白(heat shock protein, HSP) (2) 伴侣蛋白(chaperonin)
(1) 热休克蛋白(heat shock protein, HSP)
性质：热休克蛋白属于应激反应性蛋白质，高温应激可诱导该蛋白质合成。 种类：大肠杆菌的热休克蛋白包括：HSP70、HSP40和GrpE三族。 作用：可促进需要折叠的多肽折叠为有天然空间构象的蛋白质。
(2) 伴侣蛋白(chaperonin)伴侣蛋白是分子伴侣的另一家族，如大肠杆菌的Gro EL和Gro ES（真核细胞中同源物为HSP60和HSP10）等家族。 其主要作用是为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。 （九）蛋白质空间结构与功能的关系
? 酶是具有催化活性的蛋白质，同样具有一、二、三级结构，有些酶还具有四级结构。
? 自然界的酶有数千种，各种酶都具有特异的催化功能，这是由于各种酶的空间结构，特别是酶活性中心的空间构像不同所决定的。 ? 酶活性中心的空间构象是酶表现活性的关键部位，不同酶活性中心的空间构象不同，因而具有特异的催化活性。
? 酶活性中心空间构像的维持依赖于酶蛋白的二、三级结构的完整性。当酶受到各种变性因素作用时，酶蛋白空间结构破坏，活性中心的构像改变，酶失去催化活性。
2.与蛋白质错误折叠有关的疾病
? 有些蛋白质肽链错误折叠后会相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，对机体产生毒性而发病。如：纹状体脊髓变性病，老年痴呆症，疯牛病，柏金森氏病等。
? 许多神经性疾病, 淀粉样蛋白聚集在脑中 ,最常见的是老年痴呆症。在患有老年痴呆病人的脑中,塞满了由错误折叠蛋白质形成的杂乱的蛋白质簇。
（2）疯牛病的发病机理：
? 疯牛病可以通过食用病肉而被感染，它是由一种被称为朊病毒的蛋白质（prion protein, PrP)感染引起的人和动物神经系统疾病。 ? 这类疾病具有传染性、遗传性或散在发病的特点，其在动物间的传播是由PrP组成的传染性颗粒（不含核酸）完成的。 ? PrP是染色体基因编码的蛋白质，人类PrP基因位于20号染色体短臂上，编码253个氨基酸。
?正常人和动物PrP为分子量33～35kD的蛋白质，其中α-螺旋结构占整个分子的40%，β-片层结构很少甚至没有。其水溶性强，对蛋白酶敏感，称为PrPc 。
三.蛋白质—蛋白质相互作用 (一)蛋白质测序的策略
?1.确定蛋白质的纯度在97%以上。 ?2.测定多肽链的数目。 ?3.拆分多肽链。
?4.分析每一条多肽链的氨基酸组成。
?5.鉴定多肽链的N—末端和C—末端氨基酸残基。 ?6.用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段。 ?7.测定各肽段的氨基酸序列。 ?8.拼接各肽段成完整的多肽链。 ?9.确定二硫键的位置。 (二)蛋白质测序的方法
1.样品的处理为了确定蛋白质的氨基酸组分，先要将蛋白质样品水解，然后定量分析其氨基酸种类和数目。由于没有一种能使肽链完全水解而所有氨基酸不被破坏的方法，因而常采用几种不同的水解方法，以确保每种氨基酸能正确测定，常用的水解法有酸、碱和酶解法三种。 3.肽链末端氨基酸的分析：
? 2，4二硝基氟苯在pH8～9的弱碱性条件下与肽链N-端氨基酸的α-氨基结合，形成二硝基苯肽链，称为DNP-肽链。 ? 然后用酸水解，肽链中的肽键全部断裂，生成游离氨基酸。
?由于二硝基氟苯与N-端氨基缩合形成的键十分稳定，不受酸解破坏，所以水解后生成DNP-氨基酸。 ? 黄色的DNP-氨基酸可用乙醚抽提出来，用层析法鉴定即可知道N-末端是哪种氨基酸。 DNFB法原理 ②丹磺酰氯法：
? 丹磺酰氯（DNS-Cl）在pH9.5的碱性条件下能专一性的与肽链N端的氨基结合生成氨磺酰衍生物DNS-肽。 ? 经盐酸水解，得到DNS-氨基酸。
? 用乙酸乙酯提取后，用聚丙烯酰胺薄层层析可分离到DNS-氨基酸。
? 由于DNS-氨基酸在紫外线下产生强烈绿色荧光，故可用荧光分析法测出N-端氨基酸。 DNS-Cl法原理
③异硫氰酸苯酯法：
?在弱碱性条件下，异硫氰酸苯酯（PITC）与肽链N-端氨基结合后，形成苯氨基硫甲酰-肽（PTC-肽）。 ?经弱酸水解。结合异硫氰酸苯酯的N-端氨基酸残基的肽键断裂，生成苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）。 ?PTH-氨基酸可用乙酸乙酯提取出来，然后用层析法鉴定，即可确定N-端氨基酸。 ⑵C-端氨基酸的分析：
? 羧肽酶是一种外肽酶，它可专一性的切断C-端氨基酸的肽键，使C-端氨基酸游离下来，分离并鉴定游离氨基酸，即C-端氨基酸。 ? 常用的羧肽酶有A，B，C和Y四种，各具有特性：
? 羧肽酶A可水解芳香族氨基酸与侧链较大的脂肪族氨基酸所构成的C-端肽键； ? 羧肽酶B水解由碱性氨基酸构成的C-端肽键； ? 羧肽酶C专一切C-端脯氨酸的肽键；
? 羧肽酶Y能水解各种氨基酸在C-端的肽键，这是一种最适用的羧肽酶。 ②肼解法：
? 将蛋白质和无水肼在100℃反应5～10小时后，除C-端氨基酸外，其它所有的氨基酸残基都转化为相应的酰肼化合物； ? 酰肼可与苯甲醛作用形成不溶性的二亚苄基衍生物而除去； ? 剩下的氨基酸可用层析法鉴定出是哪一种氨基酸。 肼解法原理 4.肽链的分离：
? 靠非共价键结合的常用酸、碱、变性剂、去污剂等使其破坏。 ? 共价结合的，比较牢固，需用特殊的化学的作用
? 二硫键断裂法有⑴过甲酸氧化法：二硫键与过甲酸反应生成磺酸，同时二硫键断裂;⑵巯基还原法：二硫键在过量巯基乙醇，半胱氨酸，二巯基苏糖醇等存在下被还原为巯基而被打断。
? 经过解析开来的单链，可应用各种层析或电泳法予以分离。
6.肽段氨基酸序列测定：
? 常用Edman降解法，其基本原理是将肽段与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，使PITC先与肽段的N-端氨基结合，并在酸性条件下环化断裂，生成稳定的PITC衍生物，称为PTH-氨基酸。 ? 用层析法鉴定出N端氨基酸。
? 剩余的肽段再作第二轮循环分析，用于鉴定末端的第二个氨基酸。 ? 如此反复循环可确定出肽链氨基酸顺序。
? 现已将Edman降解程序引入自动系统，称为顺序分析仪。 7.肽链氨基酸序列的确定：
?将每个小肽段的氨基酸序列测出后，可用肽链重叠法确定出整条肽链的氨基酸顺序。 ?现用一个16肽为例，通过测定推测出氨基酸顺序 。
蛋白质工程（protein engineering)是在重组DNA技术应用于蛋白质结构与功能研究之后发展起来的一门新兴学科。
所谓蛋白质工程，就是通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性的对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋白质的技术，由此深入研究蛋白质结构与功能的关系。
蛋白质工程是在基因工程的基础上，融合蛋白质晶体学、动力学、蛋白质化学及计算机辅助设计等技术而迅速发展起来的一个新型研究领域，开创了按照人类意愿设计制造人类需要的蛋白质的新时期，被称为第二代基因工程。 （二）蛋白质工程的研究内容
例如：枯草杆菌蛋白酶抗氧化性改造 2.从混杂变异体库中筛选和选择具有 一定结构-功能关系的蛋白质
? 蛋白质的变异是蛋白质工程中很重要的研究内容和手段。研究者可有目的地在特定位点上使蛋白质发生变异，然后研究其结构与功能的关系。
? 如果有了一个混杂的变异体库，也可从中筛选出具有一定结构-功能关系的蛋白质。如有人把对热不稳定的酶的基因转移到嗜热生物体内，然后利用酶的某种标志（如对卡那霉素的抗性）筛选出对热稳定的酶，既保持了酶的原来性质，又增加了热稳定性。 ? 目前从非定点诱变产生的或特定条件诱发的变异体库中筛选，已得到耐热的卡那霉素核苷酰基转移酶 3.定量蛋白质结构与功能关系的研究 ?蛋白质三级结构模型的建立； ?配体结合和酶催化的性质研究； ?蛋白质折叠和稳定性研究； ?蛋白质变异研究等等。
4.根据已知结构-功能的关系人工改造蛋白质
?①通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效及独立工作能力；
?②通过改变蛋白质的结构顺序，提高其在极端条件（酸、碱、热等）下的稳定性； ?③通过改变蛋白质的结构顺序使其便于分离纯化。 微扰法
（四）蛋白质工程的基本程序：
⑴分离纯化0.1～1.0mg 目的蛋白质，测其部分肽 段的一级结构。
⑵根据肽段氨基酸顺序反向合成寡聚核苷酸，并标记同位素制成探针。⑶以此探针从基因文库中分离出编码该蛋白质的克隆基因。
⑷将克隆基因导入M13噬菌体进行扩增⑸双脱氧末端终止法测定基因的DNA序列。⑹通过表达载体使克隆基因表达获得较大量的蛋白质。 ⑺分离纯化0.1～1g纯蛋白质进行空间结构测定和结构与功能研究
⑻借助计算机辅助设计确定分子性质预测和定向改造方案⑼通过寡核苷酸M13系统进行定点诱变并分离DNA突变体。 ⑽将突变体DNA引入表达载体进行表达生产大量突变型蛋白质。 ⑾分离纯化突变型蛋白质分析其性质并进一步设计。 ⑿生产所需目的蛋白质 5.设计合成全新蛋白质
定点诱变是蛋白质工程的重要技术之一，它是通过改变克隆基因中的特定碱基，从而改造蛋白质的技术。即在体外，通过碱基取代、插入或
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