Sphingobium sp.和 Delftia sp.复合降解苯酚的研究
许甜甜，陈 军*
【摘 要】摘 要:将已分离获得的两株苯酚降解菌 Sphingobium sp.和Delftia sp.按1∶1(V/V)复合后降解苯酚的效果显著.通过Plackett－Burman试验设计得出影响两株菌复合降解苯酚的3个主效应因素分别是pH，苯酚，接种量;并由单因素试验得出复合降解苯酚的有利条件是:pH 6.0，接种量3.5%，苯酚的复合降解率随苯酚含量的增高而降低.在这个条件下，两株菌1∶1(V/V)复合后28 h内即可将500 mg·L－1苯酚完全降解，比单个菌株降解苯酚明显缩短了时间.
【期刊名称】上海师范大学学报（自然科学版） 【年(卷),期】2012(041)001 【总页数】5
【关键词】关键词:苯酚;生物降解;Sphingobium sp.;Delftia sp.;Plackett－Burman试验设计
0 引言
苯酚是重要的化工原料，也是典型的污染物，含苯酚的工业废水直接排放到环境中会对生态系统和人类造成严重威胁［1］.目前，去除工业废水中苯酚及其衍生物的方式多样，其中生物降解以分离苯酚降解菌系常见［2－4］.一般来说，使用单一微生物的纯培养降解有机化合物易生成有毒的中间体，使用具有广泛代谢特性的混合微生物培养物有可能克服这个问题［5］.由此，本研究将已经分离获得的两株苯酚降解菌Delftia sp.和Sphingobium sp.进行混合，通过条件优化，观察这两种菌复合降解苯酚的能力.
苯酚等芳烃类化合物生物降解的主要过程是首先在羟化酶作用下降解为邻苯二酚这一中间产物，继而诱导产生邻苯二酚1，2双加氧酶或邻苯二酚2，3双加氧酶邻位或者间位裂解苯环而后将其彻底降解［6］.由此，本研究选择添加诱导物邻苯二酚作为其中一个因素，观察这一因素对两种菌复合降解苯酚的影响.
1 材料与方法
1.1 实验材料 1.1.1 菌种来源
上海师范大学生命与环境科学学院发酵工程实验室保藏菌种Delftia sp.(XTT－1)和Sphingobium sp.(XTT －3). 1.1.2 培养基
M9:Na2HPO46 g，KH2PO43 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1 g，酵母膏 0.2 g，MgSO40.24 g，CaCl20.011 g，FeSO40.025 g，pH 6.5 ～6.8，加去离子水定容至 1 L. 1.2 实验方法 1.2.1 降解试验设计
Plackett－Burman设计是一类分辨率 III的二水平因子试验设计，可用来以较小代价研究许多因子.使用Plackett－Burman设计可以在试验阶段的早期识别出最重要的因子.本研究选择接种量，pH，邻苯二酚，苯酚，酵母，FeSO4共6个因素进行考察，使用 Plackett－Burman试验从中筛选确定对苯酚降解有显著影响的3个主效应因素，而后对这3个主要因素作单因素实验考察. 1.2.2 苯酚含量的测定
实验在含有50 mL无菌M9的250 mL锥形瓶中摇床培养进行，平行做3组，
取平均值为数据点.将活化的两株菌分别用无菌M9洗涤两次，并用新鲜的无菌M9分别将两株菌株制成OD6000.4的菌悬液，接入含苯酚的无菌M9中，以不接种的M9作为空白参照.苯酚含量采用4－氨基安替比林法［7］苯酚降解率由下式计算:苯酚降解率(%)=(A0－A样)/A0×100%，其中A0为不接种的空白参照试验中相应的苯酚含量，A样为接过菌种的待测样液的苯酚含量.
2 结果与讨论
2.1 两株菌的混合比例
由平板对峙实验可知，这两株菌不存在相互拮抗作用.30℃，自然pH下，将XTT－1菌(OD6000.4)和 XTT －3 菌(OD6000.4)的菌悬液分别按1∶2(V/V)，1∶1(V/V)，2∶1(V/V)混合，以单一菌悬液做参照，将混合菌悬液和单一菌悬液按2%的接种量接入含500 mg·L－1苯酚的无菌M9中.培养36 h后测定培养液中苯酚含量.结果如图1，复合降解比单一菌株降解苯酚效果显著，其中两株菌按1∶1(V/V)混合，降解效果最宜. 2.2 主效应因素筛选实验
依照Plackett－Burman实验设计方法，将1∶1(V/V)混合的两株菌的菌悬液接入含苯酚的无菌M9中，各因素的取值水平及培养20 h后各组实验结果如表1.使用Mintab软件对实验数据分析，如表2～3及图3，从显著水平上看，对苯酚降解有显著影响的前3个因素依次是pH，苯酚，接种量，而邻苯二酚这一因素(P=0.775＞0.05)相对其他因素而言并未起到关键作用. 2.3 单因素实验
选取pH，苯酚，接种量这3个主效应因素，分别考察各因素对苯酚降解的影响.在含500 mg·L－1苯酚且不同初始pH的M9中，另添加10 mg·L－1邻苯
二酚，将1∶1(V/V)混合的两株菌的菌悬液按1.5 mL(3%)接入.培养24 h，结果如图2，pH 6.0时最适合苯酚的复合降解.
在不同苯酚浓度的M9(pH 6.0)中，添加10 mg·L－1邻苯二酚，将1∶1(V/V)混合的两株菌的菌悬液按3%接入，培养24 h后测苯酚含量，结果如图4，降解率随苯酚含量的增高而降低.
在含500 mg·L－1苯酚的 M9(pH 6.0)中，另添加10 mg·L－1邻苯二酚，将1∶1(V/V)混合的两株菌的菌悬液按不同接种量接入，培养24 h后测苯酚含量，结果如图5，接种1.75 mL菌悬液最合适，即按3.5%的接种量接入. 2.4 生长与降解实验
XTT －1 菌(OD6000.4)，XTT －3 菌(OD6000.4)的菌悬液和1∶1(V/V)混合的两株菌的菌悬液，在同一条件(30℃，pH 6.0)下，按3.5%接种于含500 mg·L－1苯酚的 M9 中，另添加10 mg·L－1邻苯二酚，测定各自的生长曲线和降解曲线，如图6.混合菌悬液在28 h内即可将500 mg·L－1苯酚完全降解，比单个菌株降解苯酚缩短了时间.这可能是因为两株菌相互互补，苯酚降解时发生生物协同作用，从而加快了苯酚降解.
3 结论
Delftia sp.(OD6000.4)和 Sphingobium sp.(OD6000.4)的1∶1(V/V)混合培养物相对单一菌种降解苯酚效果是较为显著的.可能由于两株菌相互间互补，共同促进了苯酚降解.通过Plackett－Burman试验设计筛选影响两株菌复合降解苯酚的主效应因素并研究其对苯酚降解的影响，得出复合降解的有利条件:pH 6.0，3.5%的接种量时最适合苯酚的复合降解，并且苯酚的复合降解率随苯酚含量的增高而降低，在这一条件下，混合培养物28 h内即可将500 mg·L－1
苯酚完全降解.Plackett－Burman试验结果还表明诱导物邻苯二酚的添加并没有为促进苯酚降解发挥显著作用. 参考文献:
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［7］国家环境保护总局.水和废水监测分析方法［M］.4版.北京:中国环境科学出版社，2002. (责任编辑:顾浩然)
基金项目:国家自然科学基金项目(0000005472);上海师范大学科技基金项目(SK201228) *通信作者
Sphingobium sp.和Delftia sp.复合降解苯酚的研究
