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双水相萃取分离技术的研究进展及应用
学院：化学与生物工程学院 专业：化学工程与工艺 学生：李鸣昊 年级: 2012级 学号：201207547 指导老师：杨西
摘 要 双水相萃取技术是一种新兴的生物分离技术，近年来发展迅猛，因其与传统的液液萃取方法相比有其独特的优点，故双水相萃取技术的发展和应用受到了越来越多的研究专家的重视。本文综述了双水相萃取技术的基本原理、特点及应用，并对双水相萃取技术现阶段存在的问题和未来发展趋势做出简单论述。 关键词 双水相体系 萃取技术 分离技术 1 前言
近年来，随着分离技术在生命科学、天然药物提纯及各类抗生素药物生产等方面应用的需求和发展，一种新型的液液分离技术—双水相萃取技术应运而生。双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术，是利用组分在两水相间分配的差异而进行组分的分离提纯的技术。由于双水相萃取分离过程具有条件温和、可调节因素多、易于放大、可连续操作且不存在有机溶剂残留等优点，已被广泛用于生物物质的分离和提纯。在1956年，瑞典的Albertsson首次运用了双水相萃取技术来提取生物物质，开始对ATPS(双水相系统)进行比较系统的研究，测定了许多ATPS的相图，考察了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在ATPS中的分配行为，为发展双水相萃取技术打下了坚实的基础。目前，双水相萃取技术已被广泛地应用于医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域，是一项拥有广阔应用前景的新型分离技术。本文将就双水相萃取技术的原理、应用和发展情况作一简述。 2 双水相萃取原理
双水相萃取与水—有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。溶质(包括蛋白质等大分子物质、稀有金属以及贵金属的络合物、中草药成分等)在双水相体系中服从Nernst[ 1]分配定律：K= C上/ C下（其中K为分配系数，C上和C下分别为被分离物质在
上、下相的浓度）系统固定时，分配系数为一常数，与溶质的浓度无关。当目标物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数。如各种类型的细胞粒子、噬菌体的分配系数都大于100或者小于0101，因此为物质分离提供了可能。水溶性两相的形成条件和定量关系常用相图来表示，以PEG/ Dextran体系的相图为例(图1[2 ] )，这两种聚合物都能与水无限混合，当它们的组成在图1曲线的上方时(用M点表示)体系就会分成两相，分别有不同的组成和密度，轻相(或称上相)组成用T点表示，重相(或称下相)组成用B表示。C为临界点，曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是两相区，下方是单相区。所有组成在系统上的点，分成两相后，其上下相组成分别为T 和B。M点时两相T和B的量之间的关系服从杠杆定律，即T和B相重量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。
图1 PEG/ Dextran体系的相图
3 双水相萃取体系的特点
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双水相萃取成为新兴生物技术产业研究的热点，主要是该技术对于生物物质的分离和纯化表现出特有的优点和独有的技术优势。双水相体系萃取技术具有如下特点： (1) 双水相系统之间的传质和平衡过程速度快，回收效率高，相对于某些分离过程来说，能耗小，速度快。如选择适当体系，回收率可达80%，倍数可达2~20倍；
(2) 系统含水量多达75%～90%，两相界面张力极低（10～10 N·m-1），有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递，但也有系统易乳化的问题，值得注意。 (3) 分相时间短（特别是聚合物/盐系统），自然分相时间一般只有5～15min。 (4) 双水相分配技术易于连续化操作。若系统物性研究透彻，可运用化学工程中的萃
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取原理进行放大，但要加强萃取设备方面的研究。
(5) 目标产物的分配系数一般大于3，大多数情况下，目标产物有较高的收率。 (6) 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉，与其它常用固液分离方法相比，双水相分配技术可省去1～2个分离步骤，使整个分离过程更经济。
(7) 易于放大，各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低。Albertson证明了分配系数仅与分离体积有关，这是其他过程无法比拟的，这一点对于工业应用有位有利； (8) 设备投资费用少，操作简单，不存在有机溶剂残留问题。 (9) 操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行； (10)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的专一性。
由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
4 双水相萃取技术应用的影响因素
物质在双水相体系中的分配系数不是一个确定的量，它要受许多因素的影响(表2) 。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的(较大的)分配系数，从而达到分离纯化之目的，包括直接从细胞破碎匀浆液中萃取蛋白质而无须将细胞碎片分离，改变体系的pH值和电解质浓度可进行反萃取。
表2 影响生物物质分配的主要因素
4.4.1 聚合物及分子量的影响
不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄糖硫酸盐< 甲基葡萄糖< 葡萄糖< 羟丙基葡聚糖< 甲基纤维素< 聚乙烯醇< 聚乙二醇< 聚丙三醇，这种疏水性的差异对目的产物与相的相互作用是重要的。同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的和方向，若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于PEG聚合物,应降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较
高的蛋白质收率，则平均分子量应增加。 4.4.2 PH值的影响
体系的pH值对被萃取物的分配有很大影响，这是由于体系的pH值变化能明显的改变两相的电位差，如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大，则蛋白质在两相中分配越不均匀。 4.4.3 温度的影响
分配系数对温度的变化不敏感，这是由于成相聚合物对蛋白质有稳定化作用，所以室温操作活性收率依然很高，而且室温时粘度较冷却时(4 ℃) 低，有助于相的分离并节省了能源开支。
5 双水相萃取技术的应用进展 5.1 在生命科学中的应用
传统的液液萃取分离，由于使用了有机溶剂，通常会使生物大分子（如蛋白质等）失活。而双水相技术作为一种生化分离技术，由于其条件温和，易操作，可调节因素多，目前已成功应用于生命科学中蛋白质、生物酶、细胞器、氨基酸、抗生素以及生物小分子等的分离纯化。双水相萃取技术在生命科学中的应用，国内外的研究都取得了很多丰富的成果。如Miyuki通过PEG/ K3PO4双水相体系，用两步法对葡糖淀粉酶进行了萃取纯化。用第一步萃取后含有酶的下相和PEG组成双水相作为第二步萃取体系，称作两步法。葡糖淀粉酶的最佳分配条件是PEG4000(第一步)、PEG 1500 (第二步)，pH=7，纯化系数提高了3倍。张志娟等用PEG/磷酸盐双水相体系萃取青霉TS67胞外活性蛋白，研究了PEG的浓度、磷酸盐的浓度对蛋白的分配特性的影响。周念波等采用PEG-(NH4)2SO4双水相体系直接从Bacillus sp．LS发酵液上清液中分离壳聚糖酶，确定了室温下双水相萃取最佳条件为：PEG 600 20％、(NH4)2SO4 20％、NaCl 0.1％、pH值6.0，在此条件下壳聚糖酶分配系数达5.91，萃取率达88.7％。
4.2 在天然药物提取与分离中的应用
双水相萃取技术在天然药物提取与分离方面也有着独特的优势。在这方面的许多研究成果主要集中在国内。如朱自强等用8%的PEG 2000与20%的(NH4)2SO4组成的双水相系统提
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取青霉素G，分配系数高达58.39，浓缩倍数为3.53，回收率为93.67%。霍清分别研究了葛根素在PEG/(NH4)2SO4双水相体系与丙酮/K2HPO4双水相体中的分配特性，实验确定了PEG/(NH4)2SO4双水相最佳体系：PEG 1500质量分数20％，(NH4)2SO4质量分数16％，最大的分配系数可达148.2，最大收率99.09％；丙酮/ K2HPO4双水相最佳体系为：丙酮:水=8:2，K2HPO4质量为1.5g，最大的分配系数可达36.7，最大收率99.55％。刑健敏等研究了聚乙二醇/盐双水相体系中烟碱的分配行为，确定了当含盐量25%、pH=9为体系的最佳分离萃取条件，回收率为96.7%，纯度为99.87%。 4.3 在金属分离及络合物中的应用
双水相还可用于稀有金属/贵金属分离，传统的溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境，对人体有害，运行成本高，工艺复杂等缺点。双水相技术萃取技术引入到该领域，无疑是金属分离的一种新技术。据报道，在丙醇-硫酸铵双水相萃取体系中，实现了从大量基体金属如Fe2＋、Ca2＋、Mg2＋、Mn2＋、Al3＋、Pb2＋和Zn2＋中分离Pd(Ⅱ)，萃取率可达99．2％。在溴化十六烷基吡啶一双水相体系中，实现了能够使Bi(Ⅲ)与Mn(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Al(Ⅲ)等常见离子完全分离；在丙醇-硫酸铵-碘化钾双水相体系中，实现了Au(Ⅲ)的分离，获得了最佳萃取条件：HCl浓度0.6mol/L，(NH4)2SO4用量6.0g，KI浓度0.1mol/L，在最佳萃取条件下，体系对Au的平均萃取率为98.6％5 双水相萃取技术的局限和展望
目前，双水相萃取技术已被研究用于众多生物产品的分离提纯，并显示出众多其他分离技术不具备的优点，是一种应用前景广阔的新型生物分离技术。但是，要将这一技术开发应用到大规模生产过程，还有许多理论和实践方面的技术问题有待解决。在理论上，由于双水相体系中组分间的作用非常复杂，目前还没有建立一套完整的理论和方法来解释和预测物质在双水相体系中的相行为和被分配物质在两相中的分配行为。研究基本上还是通过实验进行，且研究的结果还只是建立在实验的基础上，大部分情况下不能外延，而且研究总结的成果缺乏对过程规律的认识。实践方面，双水相体系分离的成本、效率、操作条件等在实践过程中存在很多的不确定性：如双水相体系中经常使用的聚合物/聚合物构成的
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