miRNA 在重度子痫前期与正常妊娠胎盘组织中差异表达的研究

miRNA在重度子痫前期与正常妊娠胎盘组织中差异表达的

研究

蒋涛涛，孙 波＊，沈 梅，董 洁，骆 琦

【摘 要】摘要：目的分别检测重度子痫前期和正常妊娠妇女胎盘组织中微小RNA（miRNA）的表达情况，并初步探讨miRNA的差异表达在重度子痫前期发生发展过程中的意义。方法 在我院住院剖宫产分娩的产妇中，选取5例重度子痫前期患者（实验组），5例正常妊娠孕妇（对照组），通过miRNA芯片技术检测实验组与对照组胎盘组织中miRNA的表达情况。结果 本实验共检测了391个miRNA的表达谱，实验组与对照组组间比较，差异表达的miRNA共有81个，其中表达上调的有80个，表达下调的有1个，主要涉及细胞分化、血管重塑、内分泌调节等多方面的功能。结论 重度子痫前期患者胎盘组织中miRNA的表达失调可能参与了重度子痫前期的发病及病理生理过程。 【期刊名称】中国实验诊断学 【年(卷),期】2015(000)010 【总页数】4

【关键词】重度子痫前期；胎盘；miRNA；差异表达 （Chin J Lab Diagn，2015，19：1707）

子痫前期（preeclampsia，PE）是以高血压、蛋白尿等为主要临床症状的妊娠期特有疾病，国外统计其发生率为2%～8%，与孕产妇妊娠期死亡、早产及新生儿死亡密切相关［1］。其发病机制尚不清楚，但目前研究认为胎盘的病理状态与其相关［2，3］。微小RNA（m i R N A）属于单链非编码RNA，长约22个核苷酸，主要在基因的表达调控中发挥重要作用［3］。近年研究发现，胎盘

组织中miRNA表达失调可能参与了重度子痫前期的发生，然而不同研究检测出的差异表达的miRNA不尽相同［3－7］。为进一步研究miRNA与重度子痫前期的相关性，本实验应用miRNA芯片技术比较sPE患者和正常妊娠孕妇的胎盘组织中miRNA的表达情况，并初步探讨miRNA在重度子痫前期病理生理过程中的作用机制。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2014年3月至2014年5月期间在我院住院分娩的单胎初产妇共10例，其中5例sPE患者作为实验组，5例正常妊娠孕妇作为对照组，两组在年龄和孕周方面无统计学差异（P＞0.05），研究对象既往均无特殊病史，重度PE诊断标准依据苟文丽主编的《妇产科学》第八版标准。 1.2 方法

1.2.1 标本采集 胎盘娩出后5min内，在胎盘母体面无钙化区和出血点的部位采集数块面积约1× 1cm的胎盘组织，并在生理盐水中反复漂洗去除血污，干纱布吸除水分后及时放入液氮中，－80℃的冰箱保存。

1.2.2 样本总RNA的提取质检和纯化 按照Trizol法（北京博奥晶典）提取各个胎盘组织的总RNA，先予分光光度计定量，随后通过甲醛变性胶电泳试验质检总RNA的质量是否合格。对质检合格的总RNA使用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（AM1561）进一步纯化，并在纯化后再次用分光光度计定量。 1.2.3 纯化RNA的去磷酸化及标记 取纯化后的RNA 200ng，使用Agilent公司的miRNA Complete Labeling and Hyb Kit，主要步骤包括：①纯化后的miRNA5’端磷酸基团使用碱性磷酸酶CIP去除，此步为去磷酸化；②使用试剂盒中的T4RNA链接酶把Cyanine3－pCp连接到RNA3’端，完成标记；

③将浓缩抽干的miRNA放在杂交炉中过夜，完成杂交。备注：标记外标（Labeling spike－in）RNA和杂交外标（Hyb spike－in）RNA作为整个实验过程中的质控。

1.2.4 芯片清洗及扫描 先将过夜杂交的芯片置于2×SSC和0.2%SDS的混合洗液中浸泡5min，甩干玻片，再置于0.2×SSC洗液浸泡5min，洗液温度均控制在42℃左右，甩干玻片，将芯片置于使用Agilent芯片扫描仪（G2565CA）中扫描获得杂交图片。

1.2.5 统计学处理 杂交图片使用Agilent Feature Extraction（v10.7）软件进行分析后获得原始数据，原始数据需经Agilent GeneSpring软件进一步统一化处理，随后即可用GeneSpring软件对处理后的数据统计分析。FC表示两组或两个样品之间的差异倍数；以2为底、Log FC的绝对值为幂得到的对数即为FC（abs），FC（abs）值越大，表示两个样品之间的差异越大。差异表达基因筛选标准：FC（abs）＞2.0，且P＜0.05。

1.2.6 miRNA靶基因预测 通过序列查询http：／／www.mirbase.org／index.shtml和靶基因预测http：／／www.umm.uni－heidelberg.de／apps／zmf／mirwalk／index.html初步探究差异表达的miRNA在重度子痫前期病理生理过程中的调节作用。

2 结果

本实验共检测出81个差异表达的miRNA，其中仅miR－135b－5p表达下调，其余80个miRNA均表达上调，目前有16个miRNA已知其在染色体定位及靶基因，见表1，其中miR－188－5p、miR－362－3p和miR－532－3p位于同一基因簇Xp11.23上。