气相色谱质谱联用法用于甲磺酸左氧氟沙星片中甲磺酸乙酯的含量测定
[] Objective To establish a derivative gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） method for analyzing the contents of ethyl methanesulfonate （EMS） in Levofloxacin Mesylate Tablets. Methods Pre-column NaI-H2O derivating method was used， and the derivatives ethyl iodide and iodine butane were obtained from EMS and n-butyl methanesulfonate （BMS） derivatization. The derivatives were separated on a DB-WAX （0.32 mm×60 m， 0.25 μm） fused-silica capillary column firstly， and then detected by mass spectrometry under single ion monitoring （SIM） mode. The content of EMS was calculated by the area ratio of ethyl iodide to iodine butane. Results The method showed good linearity （r > 0.9999） over the range of 2.5-150 ng/mL. The limit of detection was 0.5 ng/mL， the recovery was 100.5% （RSD = 1.2%） and the repeatability RSD was 0.6% （n = 6）. The method also showed good robustness. No ethyl methanesulfonate was detected in one batch of API and three batches of tablets. Conclusion The method is sensitive， simple， accurate and rapid， and it can be used
for the determination of genotoxic impurity EMS， which may be generated in the synthesis and preparation of Levofloxacin Mesylate.
甲磺酸左氧氟沙星是左氧氟沙星甲磺酸盐的一水合物，抗菌活性是氧氟沙星的2倍，毒性低[1]。左氧氟沙星最早由日本第一制药研制开发，1996年，北京双鹤药业研制开发了甲磺酸左氧氟沙星，并于1998年在国内上市，商品名为利复星[2-3]。甲磺酸左氧氟沙星在合成和制剂过程中用到甲磺酸和乙醇，可能导致甲磺酸乙酯（EMS）的生成[4]。而甲磺酸酯类作为遗传毒性杂质[5]，研究表明可能会诱发基因突变和染色体畸变，并且对大鼠和小鼠有致癌作用[6-7]。欧洲药品局（EMEA）和美国FDA相继出台了基因毒性杂质限度的指导原则，对基因毒性杂质做出限度规定[8-10]。目前，已报道的EMS测定方法有气相色谱法（GC）[11-13]、液质联用法（LC-MS）[14-16]和气质联用法（GC-MS）[17-19]。由于GC法本身的缺陷，使得该法的灵敏度较低，而LC-MS法操作较为繁琐。本文参考欧洲药典8.0版《甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸异丙酯在原料药中的测定》[20]，建立简便、快速的衍生化GC-MS法，测定甲磺酸左氧氟沙星原料和片剂中可能存在的EMS。 1 仪器与试药
Thermo Scientific气质联用仪，Thermo公司产品，配有Trace GC ULTRA气相色谱系统，包括TriPlus AS顶空进样器、
柱温箱、TSQ Quantum三重四极杆质谱及Xcalibur数据处理软件。
甲磺酸乙酯对照品（EMS，批号：10315，纯度99.5%，Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司）；甲磺酸正丁酯对照品（批号：0143739-130930000，纯度95%，FluorochemXX公司）；甲磺酸左氧氟沙星原料（批号：AA130337，北京双鹤药业XX公司）；甲磺酸左氧氟沙星片（批号：120732、120733、120734，北京双鹤药业XX公司）；碘化钠（批号：F20110504，分析纯，国药集团化学试剂XX公司）；硫代硫酸钠（批号：F20081008，分析纯，国药集团化学试剂XX公司）；乙腈（HPLC级，Merck公司）；甲苯（批号：20121008，分析纯，北京现代东方精细化学品XX公司）；水（去离子水，Milli Q制备）。 2 方法与结果
2.1 色谱与质谱条件
气相色谱，色谱柱：聚乙二醇为固定相的熔融石英毛?管柱（DB-WAX，0.32 mm× 60 m，0.25 μm）；柱温：40℃，保持1 min；5℃/min升温至130℃；30℃/min升温至210℃，保持7 min；载气：高纯氦气，流速：0.8 mL/min，恒流模式；进样针温度：110℃；进样口温度：130℃；分流流量：10 mL/min；平衡温度：60℃；平衡时间：30 min；顶空进样。
质谱，传输线温度：210℃；离子源温度：250℃；电离源：EI源；能量：70 eV；分析器：四极杆质量分析器；监测模式：
SIM模式下监测m/z156、m/z184和m/z127，其中m/z156和m/z184分别为碘乙烷（甲磺酸乙酯衍生化产物）和碘丁烷（内标物甲磺酸正丁酯衍生化产物）的定量离子，m/z127为碘乙烷和碘丁烷的定性离子。 2.2溶液配制
2.2.1 内标溶液配制 取甲磺酸正丁酯对照品溶液10 μL，置于10 mL量瓶中，加混合溶剂[水-乙腈（20∶80）]使溶解并稀释至刻度，摇匀。取该溶液20 μL，置于100 mL量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀。
2.2.2 衍生化试液配制 称取无水硫代硫酸钠30 mg和碘化钠60.0 g，置于50 mL量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀。
2.2.3 标准工作溶液配制 称取甲磺酸乙酯对照品约25 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲苯溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取该溶液1 mL，用内标溶液稀释制成浓度为5 μg/mL的对照品储备溶液。分别精密量取对照品储备溶液适量，用内标溶液稀释制成5、10、25、50、100、150、200、250、300 ng/mL的系列浓度甲磺酸乙酯标准工作溶液。
2.2.4 供试品溶液配制 取甲磺酸左氧氟沙星片20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于左氧氟沙星25 mg，原料直接称取相当于左氧氟沙星25 mg），置20 mL顶空瓶中，分别精密加入内标溶液0.5 mL和衍生化试液0.5 mL，密封，作为供
试品溶液。 2.4 方法验证
2.4.1 专属性 称取甲磺酸左氧氟沙星片空白辅料适量（约相当于左氧氟沙星25 mg），置20 mL顶空瓶中，加内标溶液0.5 mL和衍生化试液0.5 mL，密封。结果表明，在碘乙烷出峰处，无干扰，方法专属性良好。见图1。
2.4.2 线性 分别取系列浓度的甲磺酸乙酯标准工作溶液0.5 mL，置20 mL顶空瓶中，加衍生化试液0.5 mL，密封。以溶液浓度为横坐标，碘乙烷和内标峰面积比值为纵坐标，线性回归方程为：Y = 0.002 764+0.016 08X（r = 0.9999）。结果表明：甲磺酸乙酯浓度在2.5～150 ng/mL之间，线性关系良好。 2.4.3 检测限与定量限 用内标溶液分别配制浓度为5、1、0.5、0.25 ng/mL的标准溶液，分别精密量取0.5 mL，置20 mL顶空瓶中，加衍生化试液0.5 mL，密封。碘乙烷色谱峰信噪比约为10时的浓度为定量限，信噪比约为3时的浓度为检测限。结果表明，定量限为2.5 ng/mL（图1），检测限为0.5 ng/mL（图2）。
2.4.4 回收率 取甲磺酸左氧氟沙星片20片，研细，称取适量（约含左氧氟沙星25 mg），置20 mL顶空瓶中，分别精密加入低、中、高三个浓度的对照品溶液（10、50、150 ng/mL）0.5 mL和衍生化试液0.5 mL，密封，每浓度平行3份。另称取本品细粉适量（约含左氧氟沙星25 mg），制备未加标供试品溶液。
结果表明，低、中、高三个浓度的甲磺酸乙酯平均回收率为100.5%，RSD为1.2%。见表1。
2.4.5 精密度 精密量取浓度为100 ng/mL甲磺酸乙酯标准工作溶液0.5 mL，置20 mL顶空瓶中，加衍生化试液0.5 mL，密封，平行6份。碘乙烷与内标峰面积比值的RSD为0.6%，满足分析要求。
2.4.6 溶液稳定性 新制浓度为100 ng/mL甲磺酸乙酯标准工作溶液，分别于配制后0、2、4、6、8、24 h精密量取0.5 mL，置20 mL顶空瓶中，加衍生化试液0.5 mL，密封。结果表明，甲磺酸乙酯标准溶液在室温条件下放置24 h稳定。见表2。 2.4.7 色谱系统的耐用性 精密量取浓度为100 ng/mL甲磺酸乙酯标准工作溶液0.5 mL，置20 mL顶空瓶中，加衍生化试液0.5 mL，密封。在其他条件不变的情况下，将40～130℃的升温速率分别设为每分钟4、5、6℃，各平行2份样品。结果表明，RSD [
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