基于网络药理学及分子对接探究复方“仙灵骨葆”治疗骨质疏松分子机制-关健雷 - 图文

第23卷 第2期 2021 年 2 月

JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM

辽宁中医药大学学报

Vol. 23 No. 2 Feb .，2021

DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2021.02.014

基于网络药理学及分子对接探究复方“仙灵骨葆”

治疗骨质疏松分子机制

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关健雷1，，王秋园1，，刘沛1，，习文青1，，张启栋2，郭万首2

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院，北京 100029）

摘要：目的 通过构建仙灵骨葆成分与靶点网络和蛋白相互作用网络，从而进行富集分析确定涉及的生物过程

和通路，研究复方仙灵骨葆治疗骨质疏松（osteoporosis，OP）的潜在作用机制。方法 通过检索 TCMSP 数据库筛选出仙灵骨葆的活性成分，并预测其靶点，并与 TTD 数据库、Genecards 数据库、OMIM 数据库以及 PharmGKB 数据库获得的 OP 相关靶点取交集，进而得到仙灵骨葆治疗 OP 的潜在靶点。将对比结果处理后输入 Cytoscape 软件中构建“仙灵骨葆-化合物-骨质疏松靶点”网络，利用 String 数据库和Cytoscape 构建蛋白相互作用网。后利用Bioconductor数据库进行 GO 生物功能和 KEGG 通路富集分析。最后对关键化合物及靶点进行分子对接。结果 分析结果得到仙灵骨葆89个活性成分，预测靶点1525个，3938个已知的OP发病相关的靶点基因。取疾病基因与药物靶点的交集得到153个基因靶点，经蛋白相互作用网络及拓扑分析后得到36个核心靶点，125个相互作用关系。富集分析显示主要通路集中在成骨破骨相关通路、免疫炎症通路，也有癌症、病毒感染等其他通路富集其中。进一步筛选核心靶点及化合物进行分子对接结果显示STAT3、MPAPK14、JUN、IL2以及EGFR作为核心靶点蛋白可与Cryptotanshinone（隐丹参酮）、Chryseriol（金圣草黄素）、Anhydroicaritin（淫羊藿苷元）、Quercetin（五羟黄酮）以及Luteolin（木犀草素）等小分子稳定结合。结论 该研究通过网络药理学及分子对接的方法，找到了仙灵骨葆中的可能活性成分以及骨质疏松疾病潜在靶点并预测了仙灵骨葆影响骨质疏松的关键通路：促进成骨细胞的增殖并且抑制破骨细胞的相关通路从而达到骨量的增加，此外，还作用于免疫及血管生成相关通路改善骨的微环境，从而达到治疗骨质疏松的目的。为说明仙灵骨葆治疗骨质疏松的作用机制提供了理论依据，为进一步研究相关药物治疗骨质疏松的分子作用机制、新药开发、疾病的治疗等提供了新的思路和方法。

关键词：仙灵骨葆；骨质疏松；网络药理学；分子对接

(2021) 02- 中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1673-842X 0057-09

Molecular Mechanism of Xianling Gubao Decoction（仙灵骨葆）in the Treatment of Osteoporosis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking 2222GUAN Jianlei1，，WANG Qiuyuan1，，LIU Pei1，，XI Wenqing1，，ZHANG Qidong2，GUO Wanshou2（1.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2.China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China）Abstract：Objective By constructing Xianling Gubao Decoction（仙灵骨葆）components and target network and protein-protein interaction network to carry out enrichment analysis to determine the biological processes and pathways involved，we reveal the potential mechanism of Xianling Gubao Decoction for the treatment of osteoporosis（OP）. Methods Through analyse the active ingredients of Xianling Gubao Decoction by searching the TCMSP database and predict their targets，and then intersect with the OP-related targets obtained from the TTD database，Genecards database，OMIM database and PharmGKB database to obtain Xianling Gubao Decoction potential target for treating OP. The comparison results are then input into Cytoscape to construct the“Xianling Gubao Decoction-compound-osteoporosis target”network，and the protein interaction network is constructed using the String database and Cytoscape. Subsequently，use the Bioconductor database to analyze the enrichment of GO biological functions and KEGG pathway. Finally，the key compounds and targets are screened out by the method of molecularly docked. Results The analysis results obtained 89 active ingredients of Xianling Gubao Decoction，with 1525 predicted targets and 3938 known target genes related to the pathogenesis of OP. Taking the intersection of disease genes and drug targets，153 gene targets were obtained. After analysing protein interaction network and topology analysis，36 core targets and 125 interaction relationships are obtained. Enrichment analysis showed that the main pathways are concentrated in osteoblastic and osteoclast-related pathways，immuno-inflammatory pathways，and other pathways such as cancer and viral infection were also enriched. Further analysing of core targets and compounds for molecular docking results showed that STAT3，MPAPK14，JUN，IL2 and EGFR as core target proteins can be combined with cryptotanshinone，chryseriol，anhydroicaritin，quercetin，luteolin and other small molecules which form stable binding. Conclusion This study found several possible active ingredients in Xianling Gubao Decoction and potential targets of osteoporosis through network pharmacology 基金项目：国家自然科学基金（81673776，81703896）作者简介：关健雷（1994-），男，辽宁沈阳人，硕士研究生，研究方向：骨关节外科疾病。通讯作者：郭万首（1959-），男，北京人，教授、主任医师，博士研究生导师，博士，研究方向：膝骨关节炎，膝关节单髁置换术，股骨头坏死。

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and molecular docking methods. By analysing the result，we predict the key pathways of Xianling Gubao Decoction affecting osteoporosis：promotion osteoblasts proliferate and inhibit osteoclast related pathways to increase bone mass. In addition，they also act on immune and angiogenesis-related pathways to improve the bone microenvironment，contributing to the purpose of treating osteoporosis. It provides a theoretical basis for explaining the mechanism of Xianling Gubao Decoction treatment of osteoporosis，and provides new ideas and methods for further research on the molecular mechanism of action of related drugs in the treatment of osteoporosis，new drug development，and disease treatment.Keywords：Xianling Gubao Decoction（仙灵骨葆）；osteoporosis；network pharmacology；molecular docking随着人类寿命的增加，人口的老龄化是现代社会不可避免的问题，因此骨质疏松症（osteoporosis，OP）的发病率也逐年上升，逐渐成为备受关注的公共卫生问题之一[1]。OP 的病理特点是骨量减少以及骨组织微结构异常的骨代谢性疾病，可导致骨的强度降低而增加骨折的风险[2]。本病的多发人群为中老年人及绝经后女性[3]。用于治疗OP的药物主要包括骨吸收抑制剂、骨形成促进剂、骨矿化物、雷奈酸锶以及维生素D等[4]。但从临床治疗效果及回顾文献来看，药物的治疗并不能从根本上改善骨质疏松，即重塑成骨破骨平衡以逆转病情，仅能有限地延缓疾病的进展[5]。且目前临床使用的药物靶向性不强，所以急需寻找新的思路以解决这一问题。骨质疏松在中医属于“骨痹”及“骨痿“等范畴。认为骨质疏松的发病机制以肾虚为本，与肝虚、脾虚、血瘀也密切相关[6]。故据于此，临床经验方仙灵骨葆在本院取得了较好的临床效果，该复方由淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄构成，以滋补肝肾、活血通络、强筋壮骨为治则，用于治疗骨质疏松[7]。回顾文献，现代药理学研究发现，此复方可有效增加成骨，抑制破骨从而增加骨量[8-9]，但具体是如何实现这一共功能，尚无具体研究阐述。由于中药复方成分的复杂性以及主治的多样性，使得相关实验研究不易开展，因此本研究以网络药理学的方法挖掘仙灵骨葆的主要成分的作用靶点与其疾病间的相关性，对于从细胞学、生物学以及基因等微观层次整体阐明仙灵骨葆治疗骨质疏松的作用机制具有重要意义。1?材料与方法?1.1 药物有效成分在 TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology）数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp. php）中搜索仙灵骨葆复方中所含化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为依据进行筛选候选化成分，其中丹参、知母、地黄、续断及淫羊藿在数据库中可检索到成分数据，但补骨脂成分未收录其中，故于上海有机化学研究所数据库及BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库中检索补骨脂所含成分，并对其他药物成分进行补充。于TCMSP数据库中检索相应化合物，以同样的标准，即OB ≥30%、DL ≥0.18为条件筛选有效成分，后将所有药物数据整合，得到复方中所含化合物。1.2 筛选“疾病-药物”共同靶点利用 TCMSP 数据库搜索仙灵骨葆中复方中58

的关键化学成分得到预测药物的靶点信息，并通过uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）查询与靶点相对应的人类基因名称，再与通过检索TTD数据库（https：//db.idrblab.net/ttd/）、Genecards 数据库（https：//www.genecards.org/）、OMIM 数据库（https：//www.omim.org/）以及PharmGKB数据库（https：//www.pharmgkb.org/）所筛选出的骨质疏松蛋白靶点基因进行比对，从而得到药物-疾病靶点基因的交集作为仙灵骨葆治疗骨质疏松的潜在靶点，并以R 语言中“VennDiagram”数据包绘制Venn图表示。1.3 共同靶点数据可视化为了研究仙灵骨葆治疗骨质疏松的作用机制，本研究将仙灵骨葆-骨质疏松的化学成分及蛋白靶点基因导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化，将仙灵骨葆的关键化学成分以及骨质疏松的靶点以网络图的形式展示出来。在此网络图中，关键化合物与靶点用节点表示，节点之间的相互作用关系以线段来表示。1.4 PPI网络构建PPI网络 即Protein-Protein Interaction network，也就是蛋白间的相互作用关系的网络。将上述得到的药物-疾病靶点基因的交集基因导入String 数据库（https：//string-db.org/Version 11.0），选择研究物种为人类（Homo sapiens），得到蛋白互作关系网络，将蛋白关系评分设为 0.9，并隐藏游离蛋白，蓝色连线代表基因共同进化的证据，红色连线则代表基因融合的证据，黄色连线代表文本挖掘的证据等。下载 PPI 蛋白网络描述文件，导入Cytoscape 3.7.2软件，用其软件自带network analysis功能进行分析得到网络节点间的拓扑学关系，并通过B C（Betweenness Centrality）、CC（Closeness Centrality）及度值（Degree），依次对靶点进行筛选，筛选标准设置参数为前 50% 的靶点作为核心靶点，最终获得关键靶点蛋白的PPI网络。1.5 GO（Gene Ontology）富集分析及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析通过Bioconductor数据库（http：//bioconductor.org/biocLite.R）查询靶点基因的基因ID（entrezID）。使用 R 语言软件安装Bioconductor平台相关安装包“clusterProfile”，以GO数据库对基因靶点的分子功能（Molecular Function，MF）、细胞位置（Cellular Component，CC）以及生物过程（Biological Process）三方面进行分析；使用R语言包“Pathview”，以KEGG数据库富集靶点基因参与的主要生化代谢途径，并对其关联性进行相应注释。设置 pvalueCutoff=0.05，qvalueCutoff=0.05为显著性差异《黄帝内经》 23卷 辽宁中医药大学学报 限定值，使用“ggplot2”R语言包对以上富集结果每项排名前20的数据进行柱状图绘制。最后把结果文件导入Cytoscape 3.7.2 软件中，对关键通路及靶点进行可视化分析。1.6 分子对接Vina 脚本进行分子对接[13]，以此来评估配体与化合物的结合情况。2?结果2.1 仙灵骨葆活性成分筛选与ADME（Absorption Distribution Metabolism Excretion）分析以“PPI”网络中BC、CC以及ID等参数大于中位数2倍为条件筛选出核心靶点[10]，从 PDB 数据[11]库（https：//www.rcsb.org）下载核心靶点的 3D 结构，采用 AutoDock Tools 1.5.6 软件对其进行删除水分子、添加氢原子离配体和受体、计算Gasteiger 电荷操作，输出保存pdbqt 格式。从 Pubchem 数据库[12]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载相应化合物的 3D 结构文件并转换为 pdb 格式。采用Python软件包 PyMOL对蛋白质进行去除水分子及磷酸根等操作，之后导入 AutoDock Tools 1.5.6 软件修改保存为 pdbqt 格式。最后查阅相关文献，获取相应配体活性口袋设置Gridbox 坐标及大小，运行 Autodock 分子IDMOL007088MOL003044MOL004373MOL000422MOL004425MOL000098MOL000006MOL000448MOL000449MOL002222MOL007082MOL007081MOL003152MOL004382MOL004384MOL001677MOL004386MOL000359MOL001771分子英文名称CryptotanshinoneChryseriolAnhydroicaritinKaempferolIcariinQuercetinLuteolinIsobavachinStigmasterolSugiolDanshenol ADanshenol BGentisinYinyanghuo AYinyanghuo CAsperglaucideYinyanghuo ESitosterolPoriferast-5-en-3beta-ol本研究对TCMSP数据库中仙灵骨葆组成中药：淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄中所有的已报道的成分及其ADME参数的相关检索，共搜集到有效成分共520个，其中淫羊藿130个、续断31个、丹参202个、知母81个、地黄76个，补骨脂未收录其中。在BATMAN-TCM及上海有机化学研究所数据库中共查询到补骨脂有效成分141个，根据OB≥30%、DL≥0.18的筛选原则，从仙灵骨葆复方组成中药中筛选出入血的非重复活性成分89个，部分有效成分见表1。利用TCMSP数据库相关靶点预测技术对上述89个活性成分进行作用靶点预测，共获得预测靶点1525个。OB/R.3435.8545.4141.8841.5846.4336.1654.4443.8336.1156.9757.9564.0656.96 45.6758.0251.6336.9136.91DL0.400.270.440.240.610.280.250.320.760.280.520.560.210.770.500.520.550.750.75来源丹参淫羊藿淫羊藿、知母淫羊藿、知母淫羊藿淫羊藿丹参、淫羊藿补骨脂地黄、知母、骨脂丹参丹参丹参续断淫羊藿淫羊藿知母淫羊藿地黄、续断、淫羊藿丹参、淫羊藿表1 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药活性成分筛选与ADME分子中文名称隐丹参酮金圣草黄素淫羊藿苷元山柰酚淫羊藿苷五羟黄酮木犀草素异补骨脂黄酮豆甾醇柳杉酚丹参醇A丹参醇B龙胆素醇淫羊藿A淫羊藿B灰绿曲霉酰胺淫羊藿E谷甾醇/2.2 OP相关基因检索本研究检索了4个国际公认的疾病基因相关数据库TTD、OMIM、GeneCard、PharmGKB，寻找临床与实验室研究中与OP密切相关的靶点基因，分别从中检索到44、34、4092、10 个靶点，删除重复项，共检索到3938个已知的OP发病相关的靶点基因。取疾病基因与药物靶点的交集得到153个基因靶点，证明此实验的可行性，并绘制韦恩图展示，见图1。络”的构建和分析，将上述成分及预测靶点采用Cytoscape软件进行可视化处理，对可能的活性成分和靶点之间的关系网络进行绘制和分析，共得到243个节点和885个作用关系，用以寻找网络中的关键节点，进而确定仙灵骨葆中发挥重要作用的成分和靶点。见图2。（长方形为有效成分，三角形为基因靶点；上方及外圈红色为丹参，粉色为知母，橘色为地黄，绿色为淫羊藿，下方为多个药物共有成分：黄色丹参和淫羊藿共有有效成分，土黄色为地黄、知母及补骨脂共有有效成分，深绿色为地黄、续断及淫羊藿共有有效成分，紫色为淫羊藿、知母共有有效成分）2.4 仙灵骨葆治疗OP的PPI网络构建图1 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药目标基因与骨质疏松疾病基因取交集2.3 数据可视化分析通过对仙灵骨葆与骨质疏松“成分－靶点网仙灵骨葆治疗OP的 PPI 网络构并不是单一的信号通路，而是复杂的多节点多通路的调控网络。不同信号通路和作用靶点间会存在信号转导，从而导致药物以直接调控与间接调控结合的方式治疗疾病。PPI网络分析为寻找靶点的直接、间接调控作用关系提供了契机。通过 PPI 网络的构建，将上述疾病与药物交集中的靶点输入到STRING数据库，初始网络共有137个节点、590个相互作用关系，设置筛选条件后，得到关键节点36个，125个相互作用关系，筛选过程及结果图可见图3~图4。部分核心靶点结果可见表2。59

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图2 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药成分－靶点网络图 注：依次为经过BC、CC、ID参数筛选的PPI网络图。图3 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药参数筛选的PPI网络图表2 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药核心靶点序号1234567891011121314151617潜在靶点STAT3MAPK14JUNMAPK8RELAAKT1IL2IL1BRB1NR3C1EGFEGFRCDKN1ASTAT1FOSMTORAR度值191515131312119988888777图4 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药PPI网络核心靶点60

23卷 辽宁中医药大学学报 2.5 仙灵骨葆治疗OP的GO及KEGG富集分析 2.5.1 GO富集分析使用 R 软件对“2.2”中的153个潜在作用靶点进行 GO 功能富集分析。BP结果可见图5GO生物过程（BP）富集分析共得到2072个条目，前10个及大部分条目主要涉及细胞对脂多糖的反应，细胞对细菌的反应，细胞对类固醇的反应，细胞对氧、低氧环境及活性氧化物的反应，细胞的营养程度，细胞对金属离子的反应以及细胞对酒精的反应。GO 细胞组成（CC）富集分析共得到84个条目，前10个条目主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物，细胞膜筏，膜微区，膜区，转录因子复合物，囊腔，分泌颗粒内腔，胞质小泡腔，核染色质以及转录因子复合物。GO分子功能（MF）富集分析共得到163个条目，前10个条目主要涉及核受体活性，转录因子活性，类固醇受体活性，类固醇结合程度，细胞因子受体活性，细胞因子结合程度，RNA聚合酶II活性，血红素结合程度，磷酸酶结合程度，近端启动子DNA结合转录激活子活性。2.5.2 KEGG富集分析使用 R 软件同样对142个潜在作用靶点进行KEGG 通路富集分析。结果共得到154个条目，前20个条目主要涉及MAPK通路、PI3K-Akt通路、AGE-RAGE 信号通路，IL-17 信号通路，肝炎相关通路，TNF 信号通路，人巨细胞病毒感染等通路等。详见图8及表3。图中纵坐标代表通路名称，横坐标则代表富集在该通路上的基因个数，颜色代表显著性，红色代表显著性越大，蓝色则代表富集程度较低，排序越靠前的通路，则提示该通路在仙灵骨葆治疗骨质疏松中的作用越大，但这并不一定反应真实情况，应结合临床经验及相关文献。 图5 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药GO富集分析结果61

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图6 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药KEGG富集分析结果注：红色为仙灵骨葆作用位点。图7 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药MAPK通路 图8 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药KEGG“通路-靶点”图62

23卷 辽宁中医药大学学报 表3 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药富集通路通路IDhsa04933hsa05418hsa05215hsa05167hsa05161hsa05212hsa04668hsa05222hsa04657hsa05160hsa05163hsa04659hsa05162hsa01522hsa05169hsa05219hsa05145hsa04151hsa05205通路名称度值AGE-RAGE signaling pathway in diabetic 29complicationsFluid shear stress and atherosclerosis29Prostate cancer25Kaposi sarcoma-associated herpesvirus 30infectionHepatitis B28Pancreatic cancer21TNF signaling pathway24Small cell lung cancer22IL-17 signaling pathway22Hepatitis C26Human cytomegalovirus infection30Th17 cell differentiation22Measles24Endocrine resistance20Epstein-Barr virus infection26Bladder cancer14Toxoplasmosis20PI3K-Akt signaling pathway32Proteoglycans in cancer29（淫羊藿苷元）、Quercetin（五羟黄酮）以及Luteolin[14-18]（木犀草素）作为小分子，回顾文献寻找活性中心后开展分子对接。2D及3D分子对接图见图9~图10，结合信息及参数见表4。表4 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药结合信息及参数靶点名称小分子名称PDB氢键位点Arg595Met109Leu104Glu71-Met111Asn114Lys55Met793Asp855Met793Asp855氢键长度结合能/（?）（kcal/moL）3.123.003.142.89-2.913.083.113.113.283.023.33-6.8-8.2-8.2-7.6-8.9-8.7-8.6STAT3Cryptotanshinone160254MAPK14Anhydroicaritin5318980ChryseriolIL-2JUNQuercetinLuteolin528066652803435280445EGFRLuteolinQuercetin528044552803433?讨论2.6 分子对接经过筛选最终选择STAT3、MPAPK14、JUN、IL-2以及EGFR作为核心靶点，Cryptotanshinone（隐丹参酮）、Chryseriol（金圣草黄素）、Anhydroicaritin随着平均寿命的增长，人口老龄化不可避免且呈现加速趋势，OP患者人数也逐年递增，以老年人及绝经后女性较为多见，抗骨质疏松药物缺乏针对性，且有些药物，如双膦酸盐，具有不可忽视的副作用，新药的开发也还有很长的路要走。图9 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药分子对接3D图63

辽宁中医药大学学报 23卷

STAT3与隐丹参酮 JUN与木犀草素 MAPK14与金圣草黄素 MAPK14与淫羊藿苷元 EGFR与木犀草素 IL2与五羟黄酮图10 仙灵骨葆治疗骨质疏松症用药分子对接2D图此时，中药复方在治疗OP方面发挥了极其关键的作用，中药及复方在防治OP 方面发挥着重要的作用。中医学的辨证体系认为，肾为先天之本，主骨生髓。随着人老体弱，肾气亏虚；女性绝经属肾阴亏虚，阴乃有形之物[19]。故综上所述，OP属肾虚，以肾阴、肾气亏虚为主，因此中医治疗OP以补肾为主。经验方仙灵骨葆，由淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄组成，临床有片剂、胶囊以及颗粒等制剂，在我院取得较好疗效。此方以补肾为立方之本，气血阴阳兼顾，其中五味药物在《神农本草经》中均有记载：地黄，上品，又名地髓，味甘性寒，主折跌绝筋，填骨髓，长肌肉；续断，上品，又名龙豆，味苦性温，主伤寒，补不足，金疮痈，伤折跌，续筋骨；丹参，上品，又名郄蝉草，味苦性寒，主心腹邪气，破癥除瘕；知母，中品，味苦性寒，主消渴，热中；淫羊藿，中品，又名刚前，味甘性寒，主阴痿绝伤，益气力[20]。《本草纲目》中记载有补骨脂，又名胡韭子，味辛性大温，主治元阳虚损，五劳七伤，也可治疗脾肾虚泻，[21]是补肾阳之要药。以上各味药物各司其职，伤科用药续断，效如其名，补肝肾，续筋骨；地黄、知母补肾阴，淫羊藿、补骨脂壮肾阳；辅以丹参活血化瘀，凉血止痛。相互配合，不仅可以治疗骨质疏松，也可用于骨断筋伤。此外，方中的淫羊藿，使用现代药理学技术提取出淫羊藿苷，主要用于骨质疏松的治[22-23]疗。根据OB和DL参数，共筛选出仙灵骨葆中的活性成分89个，对上述活性成分进行潜在活性成分和作用靶点的关系网络绘制，共获得153个可能的靶点和885个相互关系。经网络拓扑分析显示，Cryptotanshinone（隐丹参酮）、Chryseriol（金圣草黄素）、Anhydroicaritin（淫羊藿苷元）、Quercetin（五羟黄酮）以及Luteolin（木犀草素）等成分能作用于网络中的多个靶点，而STAT3、MAPK14、JUN、IL-2以及EGFR等靶点可能是仙灵骨葆作用于骨质疏松的关键靶点。这与部分单味中药及其他复方研究结果重合[25]。为进一步探究仙灵骨葆的药物基础，采用分子对接的方法进行深入的探究，选取了排名前三名的靶点以及临床相关的靶点与其对应化合物进行对接。在进行分子对接时，一般认为：配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大，以结合能≤-5.0 kcal/moL为标准进行筛[24]选。结果显示：各小分子均可与相应配体进行稳定结合，除IL-2靶点外均可形成稳定氢键。综上所述，仙灵骨葆的有效成分以协同的方式作用于多个64

23卷 辽宁中医药大学学报 靶点，在 OP 的各个阶段以及通路中发挥不同作用，具有治疗 OP 的前景。从KEGG富集结果可知，仙灵骨葆主要从直接影调节骨代谢以及间接调节骨代谢两方面发挥抗骨质疏松的作用：在骨质疏松相关通路中，仙灵骨葆的作用靶点主要富集在WnT 信号通路、TNF 信号通路、MAPK 通路、PI3K-Akt 信号通路、破骨细胞分化相关通路和免疫炎症相关通路等。成年人骨骼中的细胞并非一成不变，而是处于一个动态的平衡中，成骨细胞和破骨细胞的共同协作从而构成了一种动态平衡。骨细胞的来源是间充质干细胞，存在于骨髓及骨膜中，受各种通路的调节，可以分化为骨细胞、软骨细胞等。这些通路中MAPK通路和Wnt通路直接参与骨代谢的调节，其中Wnt通路可以促进间充质干细胞向骨细胞分化并可刺激成骨细胞的增殖[23]。MAPK通路主要包括ERK通路、JNK通路、P38通路和ERK5通路，可以对细胞的增殖分化、增殖以及周期进行调控，可有效调节骨的代谢平衡，被认为与骨质疏松有着密切的联系[25]。在其他骨质疏松网络药理学的文献中，有人对单味药物淫羊藿治疗骨质疏松的靶点及通路进行研究，除了本研究所富集的通路，还富集出Notch通路及TGF-β通路[25]，此二者都是在骨代谢起到重要作用的通路，之所以没在本研究结果中有所富集，可能是因为复方中药物复杂的关系所致，还有待于进一步研究。此外抑制破骨细胞分化相关通路也可以起到治疗疾病的作用。对骨代谢的间接影响也不容忽视，在明显富集的通路中也存在着其他系统的信号通路，比如PI3K-Akt 信号通路、IL-17通路、肿瘤坏死因子通路以及VEGF通路等，这说明仙灵骨葆对于骨质疏松的治疗是多系统的，可以干预免疫系统及血管生成，从而改善骨的微环境。此外通路富集结果显示，小细胞肺癌、膀胱癌等通路也有所涉及，故说明仙灵骨葆对于骨质疏松的治疗可能还涉及其他未知机制。4?结论综上所述，本研究通过网络药理学及分子药理学的方法，揭示了仙灵骨葆复方对于骨质疏松的治疗的主要机制是促进成骨细胞的增殖并且抑制破骨细胞的相关通路从而达到骨量的增加，此外还作用于免疫及血管生成相关通路改善骨的微环境，从而达到治疗骨质疏松的目的。5?展望中医的优势在于整体观念，治病求本，标本兼治以及辨证论治，从现代医学的角度来说也就是根据不同个体及所处环境进行多靶点、多系统的综合性干预，但其疗效也受限于操作者的临床经验与技能以及药物的品质与炮制工艺。本研究使用网络药理学和分子对接的手段从一定程度上揭示了仙灵骨葆对骨质疏松的治疗作用，为后续对骨质疏松相关靶点的蛋白网络构建、新药的开发以及药物临床使用提供了重要的基础。此外，本实验也为相关基础及临床实验提供了新的思路，即利用中医的综合干预的优势，与分子靶点筛选的方法结合，对复方及新药进行筛选及优化，发挥中医药和现代科学的优势，使后续研究更具合理性及指导意义。◆参考文献[ 1 ] RACHNER TD，KHOSLA S，HOFBAUER LC. Osteoporosis：now and the future[ J ] . The Lancet，2011，377 ( 9773 )：1276-1287.[ 2 ] CURTIS EM，MOON RJ，DENNISON EM，et al. Recent advances in the pathogenesis and treatment of osteoporosis[ J ] . Clin Med，2016，16 ( 4 )：360-364.[ 3 ] CHENG MH，CHEN JF，FUH JL，et al. Osteoporosis treatment in postmenopausal women with preexisting fracture[ J ] . Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology，2012，51 ( 2 )：153-166.[ 4 ] 孙亚奇，卞艳芳，周春娜，等. 中药治疗骨质疏松症研究进展 [ J ] . 中国临床医学，2018，25 ( 2 )：307-313. [ 5 ] 史东梅，董明，陆颖，等. PI3K/Akt信号通路与骨破坏：问题与机制[ J ] . 中国组织工程研究，2020，24 ( 23 )：3716-3722.[ 6 ] 董野.《黄帝内经》肾系疾病名义研究[ D ] . 沈阳：辽宁中医药大学，2014.[ 7 ] 赵岩，章轶立，谢雁鸣，等. 仙灵骨葆胶囊真实世界临床应用特征分析[ J ] . 世界中西医结合杂志，2019，14 ( 4 )：455-459.[ 8 ] 吴继云，陈伟南，蒋春华. 仙灵骨葆胶囊对大鼠骨质疏松性骨折愈合过程PDGF、TGF-β和VEGF表达的影响[ J ] . 贵州医科大学学报，2019，44 ( 5 )：541-546.[ 9 ] 陆廷茂，张军梅. 仙灵骨葆对大鼠正畸保持阶段成骨细胞和破骨细胞的影响[ J ] . 贵州医药，2016，40 ( 8 )：820-821.[ 10 ] ZHANG Y，LI Y，MAO X，et al. Thyroid hormone synthesis：a potential target of a Chinese herbal formula Haizao Yuhu Decoction acting on iodine-deficient goiter[ J ] .Oncotarget，2016，7 ( 32 )：51699-51712. [ 11 ] BURLEY S K，BERMAN H M，KLEYWEGT G J，et al. Protein Data Bank（PDB）：The Single Global Macromolecular Structure Archive[ J ] .Methods Mol Biol，2017，1607：627-641.[ 12 ] 周国威，王雨轩，夏天卫，等.基于网络药理学和分子对接法探究麻杏苡甘汤治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制[ J/OL ] . 实用中医内科杂志：1-17[ 2020-04-17 ] . https：//doi.org/10.13729/j.issn.1671-7813.Z20200196.[ 13 ] JAGHOORI，MOHAMMAD MAHDI，BORIS BLEIJLEVENS，et al. 1001 Ways to Run AutoDock Vina for Virtual Screening[ J ] . Journal of Computer-Aided Molecular Design，2016，30 ( 3 )：237-249.[ 14 ] 吴海霞，艾克白尔·买买提，王帅，等. 桦木酸通过抑制STAT3的活化提高胰腺癌细胞对吉非替尼的敏感性[ J ] . 中国肿瘤生物治疗杂志，2019，26 ( 9 )：948-954.[ 15 ] 吴晓敏. 龙须藤多甲氧基黄酮类成分的分离及其靶点预测研究[ D ] .广州：广东药科大学，2016.[ 16 ] MANISH KUMAR TRIPATHI，MOHAMMAD Yasir，PUSHPENDRA SINGH，et al. Toxic effect of chemicals dumped in premises of UCIL，Bhopal leading to environmental pollution：An in silico approach [ J ] . Asian Pacific Journal of Tropical Disease，2016，6 ( 4 )，284-290.[ 17 ] 沈霞，任丹，高静，等. 基于网络药理学复方龙脉宁方治疗脑卒中的分子机制研究[ J ] .药学学报，2019，54 ( 9 )：1588-1596.[ 18 ] 李博，刘明，胡文祥. 芬太尼类化合物与阿片μ受体相互作用的分子对接与分子动力学模拟[ J ] . 物理化学学报，2010，26 ( 1 )：206-214.[ 19 ] 孙广仁. 中医基础理论[ M ] . 北京：中国中医药出版社，2017.[ 20 ] 神农本草经[ M ] . 北京：新世界出版社，2009.[ 21 ] 李时珍.李时珍医学全书[ M ] . 北京：人民卫生出版社，2015.[ 22 ] 李聪聪，赵鹏，秦燕勤，等.淫羊藿苷的药理活性研究进展[ J ] . 中医学报，2020，35 ( 4 )：781-786.[ 23 ] 李智奎，孔俊博，赵王林. 淫羊藿苷调控Wnt/β-catenin信号通路干预大鼠MSCs成脂成骨双向分化实验研究[ J ] . 中国免疫学杂志，2019，35 ( 24 )：2985-2990.[ 24 ] 吴昊，王佳琪，杨雨薇，等. 基于网络药理学和分子对接技术初步探索“清肺排毒汤”抗新型冠状病毒肺炎作用机制[ J ] . 药学学报，2020，55 ( 3 )：374-383.[ 25 ] 刘艳伟，朱东. 低载荷机械振动下细胞骨架及MAPK信号通路对成骨细胞增殖影响的实验研究[ J ] . 医用生物力学，2019，34 ( 1 )：71.[ 26 ] 李刚，许波，梁学振，等. 基于网络药理学研究淫羊藿抗骨质疏松的分子机制[ J ] .中国药理学通报，2018，34 ( 2 )：267-273.65