第六章 微生物的生长和生理
细菌的生长繁殖表现为细菌的组分和数量的增加。
细菌个体的生长繁殖 细菌一般以简单的二分裂方式进行无性繁殖。在适宜条件下，多数细菌繁殖速度很快。细菌分裂数量倍增所需要的时间称为代时，多数细菌为20-30min。个别细菌繁殖速度较慢。
细菌群体的生长繁殖 随着群体中各个个体的进一步生长、繁殖，就引起了这一群体的生长。群体的生长可用其重量、体积、个体浓度或密度等作指标来测定。在微生物的研究和应用中，由于微生物的个体极小，只要群体的生长才有意义，因此，凡提到的“生长”时，一般均指群体生长。
第一节 微生物生长的测定
描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。 一、微生物生长量和生理指标测定法
（一）直接法
有粗放的测体积法（在刻度离心管中测沉降量）和精确的称干重法。称干重法是将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来，然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%～20%，而一个细菌细胞一般重约10-12～10-13g。该法适合菌浓较高的样品。
（二）间接法 １、比浊法：
原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。
２、生理指标法：
与微生物生长量相平行的生理指标很多，可以根据实验目的和条件适当选用。最重要的是测含氮量。蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。其他方法还包括测含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。
二、微生物细胞数目的检测法
此法适宜于测定处于单细胞状态的细菌和酵母菌，而对放线菌和霉菌等丝状生长的微生物而言，则只能计算其孢子数。
（一） 直接法
适用范围：个体较大细胞，如酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。
（二） 间接法
平板菌落计数法：可用浇注平板或涂布平板等方法进行。 1、 稀释倒平板法：
先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1，000、......）， 然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现分散的菌落，即菌落形成单位（cfu），根据每皿上形成的cfu数乘上相应的稀释度就可推算出菌样的含菌数。
2、 涂布平板法：
由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后即出现cfu，用上述方法就可以推算出菌样的含菌数。
第二节 微生物的生长规律
一、单细胞微生物的生长曲线
定量描述液体培养基中单细胞微生物群体生长规律的实验曲线，称为典型生长曲线。当把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的温度、通气等条件下，该群体就会由小到大，发生有规律的增长。通常以细胞数目的对数值为纵坐标，以培养时间为横坐标，就可以绘出微生物的典型生长曲线，以反映微生物群体生长规律。根据微生物的生长速率常数，即每小时的分裂次数的不同，典型生长曲线可分四期：
1、迟缓期 细菌进入新环境后的短暂适应阶段。该期菌体增大，代谢活跃，为细菌的分裂繁殖合成并积累充足的酶、辅酶和中间代谢产物；但分裂迟缓，繁殖极少。迟缓期长短不一，按菌种、接种菌的菌龄和菌量，以及营养物等不同而异，一般为1～4h。
2、对数期 又称指数期。细菌在该期生长迅速，活菌数以恒定的几何级数增长，生长曲线图上细菌数的对数呈直线上升，达到顶峰状态。此期细菌的形态、染色性、生理活性等都较典型，对外界环境因素的作用敏感。因此，研究细菌的生物学性状（形态染色、生化反应、药物敏感试验等）应选用该期的细菌。一般细菌对数期在培养后的8～18h。
3、稳定期 由于培养基中营养物质消耗，有害代谢产物的积聚，该期细菌繁殖速度渐减，死亡数逐渐增加，细菌形态、染色性和生理性状常有改变。一些细菌的芽胞、外毒素和抗生素等代谢产物大多在稳定期产生。
4、衰亡期 稳定期后细菌繁殖越来越慢，死亡数越来越多，并超过活菌数。该期细菌形态显著改变，出现衰退型或菌体自溶，难以辨认；生理代谢活动也趋于停滞。因此，陈旧培养的细菌难以鉴定。 二、细菌的新陈代谢产物
细菌在其物质代谢过程中，除利用各种营养物质合成菌体和产生能量外，还可产生出多种代谢产物，其中有的对人和动物是有害的，有的可供鉴别细菌之用，有的可供制医药之用，现将有关的代谢产物分述如下。
（一）分解产物
1.糖分解产物 细菌分解糖类后，可以产生有机酸（主要为乳酸、醋酸、丙酮酸、酪酸等）、气体（主要为CO2、H2和沼气等）和醇类。
2.蛋白分解产物 细菌应用各种蛋白酶分解蛋白质，其最后产物包括有机酸、胺类、靛基质、硫化氢、硫醇、CO2和氢等。
上述各种产物中，分解糖类产生的酸和气体以及分解蛋白质产生的硫化氢、靛基质等，因细菌种类而有区别。据此特点，可利用生物化学方法来鉴别细菌。常见的细菌生化反应试验有：
氧化酶试验 氧化酶又名细胞色素氧化酶，细胞色素氧化酶C或呼吸酶，试验用于检测细菌是否有该酶存在。原理是氧化酶在有分子氧或细胞色素C存在时，可氧化四甲基对苯撑二胺，出现紫色反应。假单胞菌属、气单胞菌属等为阳性。肠杆菌科为阴性。
触酶试验 触酶又名接触酶或过氧化氢酶，滴加过氧化氢能被催化分解为水和氧。乳杆菌及许多厌氧菌为阴性。
氧化发酵（O/F）试验 不同细菌对不同糖的分解能力及代谢产物不同，有的能产酸并产气，有的则不能。而且这种分解能力因是否有氧的存在而异，在有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发酵。试验时往往将同一细菌接种相同的糖培养基一式两管，一管用液体石蜡等封口，进行“发酵”，另一管置有氧条件下，培养后观察产酸产气情况。O/F试验一般多用葡萄糖进行。
目前“糖发酵”一词已泛指有氧及厌氧状况下细菌对糖的分解反应，如不加特别说明的，均是有氧状况。
VP试验 由Voges和Proskauer两学者创建，故得此名。大肠杆菌和产气肠杆菌（Enterobacter aerogens）均能发酵葡萄糖，产酸产气，两者不能区别。但产气杆菌能使丙酮酸脱羧，生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被空气中分子氧所氧化，生成的二乙酰与培养基中含胍基的化合物发生反应，生成红色化合物，为阳性。大肠杆菌不能生成乙酰甲基甲醇，故为阴性。
甲基红试验 在VP试验中，产气杆菌分解葡萄糖，产生的2分子酸性的丙酮酸转变为1分子中性的乙酰甲基甲醇，故最终的酸类较少，培养液pH>5.4；以甲基红（MR）作指示剂时，溶液呈橘黄色，为阴性。大肠杆菌分解葡萄糖时，丙酮酸不转变为乙酰甲基甲醇，故培养液酸性较强，pH≤4.5，甲基红指示剂呈红色，则为阳性。
枸橼酸盐利用试验 某些细菌（如产气肠杆菌）能利用枸橼酸盐作为唯一的碳源，能在除枸橼酸盐外不含其他碳源的培养基上生长。分解枸橼酸盐生成碳酸盐，并分解其中的铵盐
生成氨，使培养基由酸性变为碱性，从而培养基中的指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）由淡绿色转为深蓝色，为阳性。大肠杆菌不能利用枸橼酸盐为唯一碳源，在该培养基上不能生长，培养基颜色不改变，为阴性。
吲哚试验 有些细菌如大肠杆菌、变形杆菌、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）等能分解培养基中的色氨酸生成吲哚。如在培养基中加入对二甲基氨基苯甲醛，则与吲哚结合生成红色的玫瑰吲哚，为阳性。
硫化氢试验 有些细菌如变形杆菌等能分解胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸，生成硫化氢。若遇醋酸铅的硫酸亚铁，则生成黑色的硫化铅的硫化亚铁。
脲酶试验 脲酶又名尿素酶。变形杆菌有脲酶，能分解培养基中的尿素生产氨，使培养基的碱性增加，可用酚红指示剂检出，为阳性。沙门氏菌无脲酶，培养基颜色不改变，则为阴性。
细菌的生化反应主要用途是鉴别细菌，对革兰氏染色反应和菌体及菌落形态相同或相似的细菌尤为必要。其中吲哚（Ⅰ）、甲基红（M）、VP（Vi）、枸橼酸盐利用（C）四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。例如大肠杆菌对这四种试验的结果是++--，而产气肠杆菌则为--++。 （二）合成产物
这里所指的合成产物，是指菌体成分以外的其他合成物质。
1.毒素 病原性细菌可以合成各种有毒物质，称为毒素。毒素和细菌的致病作用有直接关系，它又分外毒素和内毒素两种。外毒素是蛋白质，内毒素则是糖、磷脂和蛋白质的复合物。
2.酶 细菌除合成其新陈代谢所必需的酶以外，还合成以下几种酶，这些酶在代谢过程中的作用尚不明了，但和细菌的致病性有一定关系。包括：卵磷脂酶、胶原酶、透明质酸酶、凝血浆酶、溶纤维蛋白酶和溶血素。另外有的细菌还能合成明胶溶解酶和凝乳酶，可引起明胶液化和牛乳凝固现象。这些现象往往可以作为鉴定细菌的参考。
3.抗生素 许多细菌、放线菌、真菌可以合成抑制或杀灭其他种微生物或肿瘤细胞的物质，称此物质为抗生素。例如青霉菌产生的青霉素、灰色链丝菌产生的链霉素、委内瑞拉链丝菌产生的氯霉素和金色链丝菌产生的金霉素等等。
4.维生素 某些种细菌和酵母有合成维生素的能力。一般认为大肠杆菌所合成的维生素是动物所需维生素的重要来源。
5.色素 某些细菌在适宜的条件下能产生色素。其中有些溶于水，可使菌落及培养基着色。如杀鲑气单胞菌的褐色色素。有些不溶于水，但溶于酒精。故只能使菌落本身着色，例如葡萄球菌、八联球菌的色素。色素对于细菌的鉴别有一定价值，例如葡萄球菌的分型，按照其所产生的色素是分型的依据之一。
第三节 影响微生物生长的主要因素
一、温度对微生物的影响
温度是影响微生物生长的最重要因素之一。
温度对微生物的影响具体表现在：①影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。②影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。③影响物质的溶解度，对生长有影响。
（一）微生物生长的三个温度基点
从微生物整体来看，生长的温度范围一般在-10 ℃ ~100 ℃，极端下限为-30 ℃，极端上限为105~300 ℃。但对于特定的某一种微生物，只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度。
（二）微生物生长温度类型
根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：低温型微生物（嗜冷微生物）、中温型微生物（嗜温微生物）和高温型微生物（嗜热微生物）。微生物的生长温度范围见表7-1。
表7-1 微生物的生长温度类型
类型
最低
嗜冷型 嗜温型 嗜热型
专性嗜冷 兼性嗜冷 嗜室温 嗜体温 嗜热 极端嗜热
1、嗜冷微生物：
最适生长温度在5~20℃，有专性和兼性之分，前者只能在低温下生长，环境温度不能超过20℃，一般分布在终年冰冻的两极地区。后者分布较广，主要存在于海洋、河流、湖泊及冷藏食品上，包括细菌、真菌等的一些种属，冷藏食品的变质常常是由它们引起的。
2、嗜温微生物：
嗜温型微生物适于在25～40℃生长，自然界中多数微生物属于这种类型，它们广泛分布于土壤、水、空气和动植物体及其生活的各种环境。人和动物的病原微生物也属该类型，不过人和恒温动物的病原微生物为体温型，最适生长温度和人工培养温度为37℃。水产动物等变温动物的病原微生物为室温型，最适温度为18～28℃，人工培养温度为28℃。
3、嗜热微生物：
嗜热型微生物又分嗜热和极端嗜热两种类型，前者存在于堆肥和沼气发酵池等环境中，后者存在于温泉、大洋底火山喷口及高强度太阳辐射的土壤和岩石表面等处。嗜热微生物生物大分子蛋白质、核酸、类脂的热稳定结构、热稳定性因子和质粒携带与热抗性相关的遗传信息是它们能抗热的主要原因。嗜热微生物在高温发酵、污水处理中有很好的应用前景。
-12 -50 10～20 10～20 30 30
生长温度范围℃
最适 5～15 10～20 18～28 37 45～60 70～90
最高 15～20 25～30 40～45 40 70 100以上
两极地区 海水及食品冷藏处 水生生物、植物及环境 恒温动物病原微生物 堆肥和沼气发酵地等 温泉和海洋底火山口 分布主要处所
水产微生物—微生物的生长和生理
