的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标志其他探针（如核素等）的。
八、洗涤
用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。 然后5mins *5。
洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。
九、显色（HRP酶） 1．增强化学发光法(ECL)
Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：
鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。 试验步骤：
1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。
2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。
3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。
4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。 5）显影、定影。
6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。 注意：荧光在一段时间后会越来越弱。 2.DAB显色
DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。
对于AP标记的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。
十、分析结果及其判断
常见问题原因分析及处理方法： 见附录一、二。
附录一：Troubleshooting Blotting Problems （P43－48）
附录二：Western Blotting Troubleshooting Logic Tree （P390－394）
附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液
1) 5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7:
Stock: to use:
20% Glycerol 100ml take 9.5ml stock 10% SDS 50g or 250ml 20% SDS add BME 0.5ml
250mM Tris 15.14g bromphenol blue or total 475.00ml pyronine 4 to taste 2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix): 0.8 bis-acrylamide 0.8g 29.2% acrylamide 29.2g total 100ml
3) 2x Laemmli Separation Buffer:
0.75M Tris-HCl 90.825g 0.2% SDS 10ml 20% SDS total 1000ml pH8.8
4) 2x Laemmli Stacking Buffer:
0.25M Tris 15.14g 0.2% SDS 1g total 500ml pH6.8
5) 10x Laemmli Running Buffer:
250mM Tris 60.55g 1.9M Glycine 285.27g 1% SDS 20g total 2 liters pH8.3
6) Transfer Buffer:
48mM Tris base 5.81g
39mM Glycine 2.93g 0.037% SDS 0.375g 20% MeOH 200ml total 1000ml 7) TBST:
10mM Tris-HCl， 1.21g 100mM NaCl 0.2% Tween-20 Total 1000ml pH7.4
8) Coomassie Stain :
40%MeOH 400ml
10%HAc 100ml
0.1?R 1g Brilliant Blue R total 1000ml 9) Destain:
30%MeOH 300ml 7.5%HAc 75ml total 1000ml 10) 10×丽春红染液配方： 丽春红 2g 磺基水杨酸 30g 三氯醋酸 30g
total 100ml 11）DAB
DAB 50mg 0.05mol/L TB （PH7.6） 100ml 30%H2O2 30-40ul
先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存，H2O2在工作液中终浓度0.01％。
Western blot的原理、操作及注意事项
