第十一章植物细胞培养
内容
1.植物细胞培养的应用 2.植物细胞培养的培养基 3.愈伤组织的诱导 4.单细胞培养 5.细胞团培养
6.植物细胞规模化培养 一、植物细胞培养的应用 1.细胞产物的工厂化生产
2.植物繁殖的新途径（快速繁殖，作物脱毒，人工种子） 3.作物新品种的培育（单倍体育种，突变体的利用） （实例：红豆杉生产紫杉醇） 二、植物细胞培养的培养基
无机盐： 大量元素：N, P, K, Ca, Mg, S, Na; 微量元素：Fe, Mn, Cu, Zn, Mo, Cl, B. 有机物质：
1）糖类（蔗糖，葡萄糖，麦芽糖，果糖，可溶性淀粉等），作用：为细胞提供合成新物质的骨架；为细胞代谢提供能量；维持培养基合适的渗透压； 2）维生素：硫胺素（VB1）、烟酸、泛酸、吡哆醇等等；
3）氨基酸：甘氨酸，精氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺等等，因培养基的种类不同其添加种类浓度不同。
4）肌醇：促进糖类相互转化，维生素，激素的利用作用，使培养物快速生长。
5）有益有机添加剂或未知复合成分如麦芽提取物，椰乳，提供一些必要的微量营养成分，生理物质和生长激素等。
非生长必须的添加物：非植物生长必须，但对细胞生长有利。 1）琼脂：用于使培养基凝固；
2）活性炭：用其吸附能力减少有害物质的影响；
3）激素：是各成分中对培养物影响最大，最重要的的调控手段。种类、浓度、配比都会影响愈伤组织的形成和分化。天然的如脱落酸，合成的如二氯苯氧乙酸，细胞培养常用到的是生长素和细胞分裂素。①生长素指能引起完整组织中的细胞扩展的化合物，组织培养中组要作用是：诱导愈伤组织的形成胚状体的产生以及试管苗的生根，配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生。②细胞分裂素，自然界中影响细胞分裂顶端优势变化和茎的分化。组织培养中用于促进细胞分裂和愈伤组织上或器官上分化不定芽，叶片扩大，茎长高，抑制根的生长，与生长素相互配合用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官的形成。
三、愈伤组织的诱导
愈伤组织（重点）：原指植物体受伤时产生于伤口周围的组织。外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。特点：细胞分裂快，缺少有组织的结构，能维持期不分化的状态。愈伤组织是实现全能性的主要途径。
愈伤组织诱导和再分化过程：①启动期；②遇上组织诱导；③拟分生组织形成；④器官原基和器官的形成。（人工制备愈伤组织实质是分化的外植体细胞脱分化的过程）。
愈伤组织诱导的条件：激素（一般是生长素）；培养基（MS高盐培养基）；其他添加物
（硝酸银，抑制内源乙烯）。 愈伤组织类型：
紧密型：愈伤组织内无大的细胞间隙，细胞间被果胶紧密结合，不易形成良好的悬浮系统。
松脆型：内有大量大的细胞间隙细胞排列无次序，容易分散成单细胞或少数几个细胞的小细胞团。（松散性好、增值快、再生能力强的愈伤组织更适合用于分离悬浮培养所使用的细胞系）
四、单细胞培养
定义：是从外植体、愈伤组织、细胞团中分离得到单细胞，然后再一定条件下进行培养的过程。
外植体的选择和制备：（外植体）从活植物体上切下进行培养的那部分组织或器官。（程序略）注意问题：植物类型（能够产生目的化合物的植物种类品种或单株）和器官类型（组织器官的特异性，选自然状态下产生天然产物的器官组织）的选择
植物单细胞的获取：
1）直接从外植体获得，外植体切割捣碎过筛，得到细胞悬浮液；
2）从愈伤组织获取单细胞，经过愈伤组织诱导获得脱分化愈伤组织的薄壁细胞团，细胞团到液态培养基进行震荡培养，使之分散成单细胞，过筛获得单细胞悬浮液；
3）通过原生质体再生法获取单细胞，外植体、愈伤组织或细胞团经过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁获得原生质体，原生质体分离后一定条件下下进行培养使细胞壁再生，获得单细胞悬液。 植物单细胞培养的方法：
1）细胞平板培养：将一定密度的悬液细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术 2）看护培养：固体培养基上置入一活跃生长的愈伤组织，其上方一小片滤纸，滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上，当细胞长出微小细胞团以后，将其直接转至琼脂培养基上让其迅速生长。（愈伤组织给单细胞传递了某些生物信息，或为单细胞的生长繁殖提供了某些物质，如植物激素等内源化合物）
3）微室培养：将接种有单细胞的少量培养基，至于微室中培养，使单细胞生长繁殖的方法。可以通过显微镜观察单个细胞的生长分裂、分化发育情况，利于对细胞特性和单个细胞生长发育的全过程进行跟踪研究。
五、细胞团培养
小细胞团是指由2-8个植物细胞聚合在一起而形成的细胞团块。小细胞团培养使将小团块接种于培养基中，在一定条件下进行培养的过程。 植物小细胞团的形成
1.愈伤组织分割法：在无菌条件下用镊子或小刀将愈伤组织块分割成为小细胞团的过程。 2.单细胞培养过程单细胞经过分裂繁殖也形成细胞团
3.细胞团分散法是通过机械搅拌或通入无菌空气等在剪切力的作用下使大细胞团分散成为小细胞团。 细胞的同步化
同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 化学方法： ①饥饿法，断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿以后，重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。②DNA
合成抑制，通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA合成前期，当解除抑制后即可获得处于同一细胞周期的细胞。如5-羟基尿嘧啶，羟基脲等。③有丝分裂阻抑，用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度0.2%，时间4-6h。 物理方法：
①分选法，通过细胞团体积大小分级，直接将处于同一细胞周期的细胞进行分选，将同一状态的细胞继代培养与同一培养体系中。
②冷处理法，低温处理可以提高培养体系中的细胞同步化程度。
（同步化处理方法对于细胞都有所伤害，在同步化处理前需进行充分的活化培养）
六、植物细胞培养的规模化（重点） 植物细胞培养特性：
植物细胞大抗剪切力差；
培养过程生长缓慢，易受微生物污染，需加抗生素； 细胞生长中期和对数期易凝聚成团，悬浮培养困难； 培养时需供氧，培养难度大； 具有群体效应；代谢产物产量低；
细胞培养过程具有结构和功能的全能性，易分化； 悬浮培养要求有一定的细胞浓度否则不生长。 关键影响因素：
细胞系的质量（分散性，产量，生长速度）； 接种细胞密度； 培养液的流变特性；
剪切力（植物细胞对剪切力的敏感是主要技术问题，表现出机械伤害，使细胞团变小，细胞破损等）； 气体成分；
其它（温度，pH，光照，泡沫） 培养方式和反应器：（应适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力） 悬浮细胞培养反应器：搅拌装置改叶轮式为螺旋式，或气体搅拌塔生物反应器，气升式，鼓泡塔。
固定化培养系统：细胞位置固定在支持物上，培养基可以不断更换免除培养基中的出生代谢产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞抑制留在反应器中可以重复利用，节省了生产细胞的时间和费用。分两类：包埋式固定化培养系统（支持物用琼脂，琼脂糖，藻酸盐等）；附着式固定化培养系统（尼龙网，聚氨酯泡沫）。固定化细胞反应器：填充床；涓流床反应器。
第十二章生化生产实例
内容：
1.抗生素发酵——青霉素 2.有机酸发酵——乳酸
3.生物能源产品——燃料乙醇 4.基因工程菌发酵简介
一、抗生素发酵
抗生素：生物在其生产活动中所产生的能在低浓度在有选择地杀死其他微生物或者肿瘤的有机物质。一般是生物体的次代谢产物。（弗莱明发现青霉素，瓦克斯曼发现链霉素）
青霉素生产菌：弗莱明从点青霉代谢产物分离得到青霉素；产黄青霉。
青霉素生产过程：乳糖为最佳糖源；玉米浆为最佳氮源（实际用黄豆饼粉，花生饼粉、尿素等）；苯乙酸及其衍生物为前体；青霉素发酵采用补料工艺（避免基质高浓度对菌体抑制和后期低浓度限制产物合成）；最适pH6.5左右；菌体主要有丝状生产和结球生产两种形态。
分离提取：
1）过滤和预处理，冷却，调pH过滤，加PPB和硅藻土助滤。 2）萃取，乙酸丁酯为萃取剂。
3）结晶，在萃取液中加乙酸钾或乙酸钠，青霉素的钾盐或钠盐析出 二、乳酸发酵
乳酸菌：非分类学名词，习惯叫法，能在可利用碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌。
乳酸发酵微生物：根霉，德氏乳酸杆菌，鼠李糖乳杆菌。
三、乙醇发酵
淀粉和糖质原料是传统的酒精发酵原料。 木质纤维素原料是潜在原料。
乙醇发酵微生物：酵母—酿酒酵母；细菌—运动发酵单胞菌。 四、基因工程菌的发酵 原核表达系统：大肠杆菌
真核表达系统：酿酒酵母；毕赤酵母
大肠杆菌表达系统：1）不具有真核细胞翻译后的修饰加工功能；2）蛋白在大肠杆菌内多数为非分泌型表达；3）真核细胞在细胞内高度表达但又不能分泌到胞外，常形成不溶的包涵体。
酿酒酵母表达系统：优点：生长繁殖快；遗传背景清晰；安全可靠；可对真核基因进行翻译后修饰；能分泌外源蛋白。缺点：对蛋白加工能力有限；不合适高密度培养，难以实现外源蛋白的高效表达。
毕赤酵母表达系统：略。
发酵过程特征：1）追求高密度；2）外源蛋白的表达需要诱导。
国科大研究生课程-生化生产工艺笔记教材
