一、工业微生物基础
1.1常见工业微生物
细菌：生化生产过程常见细菌：醋酸杆菌，乳酸杆菌、芽孢杆菌大肠杆菌，用于各种酶制剂、有机酸、氨基酸和肌苷酸等，同时细菌还常被用于基因工程，做载体的宿主细胞，构建基因工程菌生产外源物质。
放线菌：在培养基表面菌落呈放射状而得名。介于细菌和真菌的单细胞微生物。多数腐生菌少数寄生菌。有发育良好的菌丝体但无横隔，单细胞菌丝，原核。土壤土腥味即使放线菌散发。菌落特征：干燥不透明，表面呈紧密细绒状，上面有一层色彩鲜艳的干粉；菌落和培养基紧密结合，难以挑取；菌落颜色的正反面常不一致，菌落边缘培养基的平面有变形的现象等。链霉菌属，小单孢菌属。
霉菌：是一群在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体真菌的通常，并非微生物分类学上的名词。菌落特征与放线菌相近：形态较大，质地比放线菌疏松，外观干燥不透明，呈现或紧或松的绒毛状、蜘蛛网状或絮状，菌落和培养基紧密结合，难以挑取；菌落颜色的正反面常不一致。霉菌繁殖能力很强，能以无性孢子和油性孢子进行繁殖，多以无形孢子繁殖。曲霉属：黑曲，米曲，黄曲霉。青霉属、根霉属。
酵母菌：单细胞真核微生物。形态多样，卵形为主，还有球形、椭圆形、柠檬形腊肠型及荷藕型。生长温度范围4-30℃，最适温度25-30℃。也不是微生物分类学的名词，以出芽方式进行无性繁殖的真核微生物总称。菌落特征与细菌相仿，但要较不透明，颜色单调，多呈乳白色或矿烛色，少数红，个别黑色。菌落发出悦人酒香味。 噬菌体：凡用细菌和放线菌为生长菌株的发酵工业菌存在噬菌体危害问题，那么真菌存在吗,假丝酵母、酿酒酵母的培养是否会有噬菌体危害？木霉呢？ 1.2微生物菌种的分离
菌种分离的步骤：
采样：土壤，根据所需菌株确定采样地 样品与预处理：物理、化学、生物
增殖培养：给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件以促使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离。
纯种分离: 平板划线法，稀释分离法，涂布分离法，毛细管分离法、小滴分离法等等。 （最常用的平板划线法和稀释分离法的步骤与注意事项）
性能测定：两步法，初筛和复筛。多次重复筛选直至获得1-3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产试验。
（筛选方法？） 诱变育种
1.3工业微生物菌种的改良
微生物在长期进化中形成了一整套精密的代谢控制机制，一般不会过量代谢或生产超过自己生长、代谢所需要的酶或者代谢产物。打破其原有的代谢控制机制，进行目的产物的过量生产是菌种改良的主要问题。
原生质体技术育种：包括原生质体诱变、原生质体转化或转染和原生质体融合等。 体外DNA重组技术育种：基因工程。
代谢工程育种：通过改变微生物的代谢流和代谢途径来提高发酵产品的产量、改善生产过程、扩展或构建新的代谢途径和产生新的代谢产物。 1.4工业微生物的保藏
保藏方法：斜面保藏法、穿刺保藏法、干燥保藏法、悬液保藏法、冷冻干燥保藏法（保藏机构主要保藏方法）、液氮保藏法、低温保藏法、石蜡油封保藏法、沙土管保藏法、菌丝
速冻保藏法。
（保藏的具体步骤方法） 国内外一些保藏机构：ATCC（美国典型培养物收藏所）、CSHL（美国冷泉港实验室）、IAM（日本东京大学应用微生物研究所）、IFO（大阪发酵研究所）、KCC（日本科研化学有限公司）、NCTC（英国国立典型培养物收藏所）、NIH（美国国立卫生研究所）NRRL(美国农业部北方开发利用研究部)；中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCMS)下设6个微生物菌种保藏中心：普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC），农业微生物菌种保藏管理中心（ACC），工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC），抗生素菌种保藏管理中心（CACC），兽医微生物保藏管理中心（CVCC）。
1.5工业微生物菌种的培养与扩大培养 微生物的培养方法： 表面培养 固体培养 液体深层培养 菌种的扩大培养：
从实验室制备到车间生产用菌种的过程。将保存在沙土管或冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养从而扩大培养，获得一定数量和质量的纯种。（P32）
扩大流程：冷冻或沙土孢子 接种到斜面活化 摇瓶/茄子瓶/固体培养基培养/ 种子罐培养 发酵罐。 流程中的一些问题：
斜面菌种不宜多次移接避免变异引起不纯，还要常进行分离纯化.（分离纯化的原理步骤，鉴于变异出来的，可能差别不大，难以分离）
一级种子培养用摇瓶等，一些工厂不用，如谷氨酸工厂，而是培养大型斜面作为一级种子使用。
二级种子培养用种子罐，大小根据需要发酵产品和大胶管的容积配套确定。
种子罐级数：即制备种子需要逐级扩大培养的次数，根据种子的生长特性，孢子发芽及菌体繁殖速度以及发酵罐的容积定。生长快的菌种子用量少种子罐数量少，如谷氨酸生产。抗生素生产菌种生长慢。二级种子罐扩大培养，三级发酵。
接种龄与接种量：
接种龄是种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐时的培养时间。通常接种龄以菌丝处于生命极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体尚未到达最高峰较为合适。过于年轻的种子接入发酵罐往往前期生长缓慢整个发酵周期延长；过老种子引起生产能力下降而菌丝过早自溶。
接种量是移入的种子液体积和接种后培养液体积额比例。较大的接种量可以缩短发酵罐菌丝繁殖到达高峰的时间，过多则菌丝生长过快，培养液粘度增加，造成溶解氧供应不足而影响产物的合成。生产上多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。双种法：两只种子罐接一只发酵罐；将适宜发酵液倒出给另一个罐子做种子，倒种法。
第二章菌种制备原理与技术
对工业微生物的基本要求：
1.遗传上稳定（能够长期使用）。
2.易于生产营养细胞、孢子或者其他繁殖体（方便操作）
3.一般要求纯种，不应带杂菌和噬菌体，同时最好有自身保护机制，抵抗杂菌、噬菌体能力强（减少染菌事件）。
4.产生所需产物的时间尽量短。 5.产物容易分离提取。 获取工业微生物的途径：
1.向菌种保藏机构或者同行索要或购买。 2.采集样品分离筛选。 3.对现有菌种进行改良。
一、微生物的分离
样品采集—单菌落分离—筛选（—鉴定）—保藏—复壮 样品采集：
根据环境特点采用（基质含量通气状况、酸碱度植被分布、地理条件、季节条件）：ph7-7.5放线菌合适；小于7霉菌，酵母菌生产旺盛，夏季微生物生产旺盛，冬季缓慢。
根据微生物生理特点采样：营养类型，腐烂木落叶中纤维素酶产生菌多，饭店排污沟-脂肪蛋白酶产生菌多等等。生理特性，高温酶产生菌-温泉，低温酶产生菌-两极深海，冰窖等。
单菌落分离：稀释涂布法，划线分离法，组织分离法
组织分离法：切取小块含菌组织，干净水洗去表面污物，表面消毒（10%漂白粉浸泡205min）无菌水洗干净，置于平板上适当温度培养，挑取单菌落，分离纯化。
筛选：初筛，从大量分离得到的微生物中将有用微生物筛选出来的过程。可在平板上通过生化反应筛选，也可在摇瓶进行，目的淘汰大量不符合要求的微生物。复筛，摇瓶实验，重复3-5个平行，目的从初筛得的菌株中找到所需要的微生物。
菌株鉴定：依照权威手册（《伯杰氏细菌鉴定手册》），或委托专门机构鉴定。
保藏和复壮：保藏原则：最好使用休眠体，创造合适长期休眠的条件（干燥、低温、避光营养贫乏）
菌种退化原因：自发突变，传代过程之质粒丢失。
避免方法：减少传代次数，经常纯化，控制培养条件，单核细胞传代。 复壮方法：纯化、淘汰衰退个体，宿主体内培养。
二、诱变育种（重点）
诱变育种：微生物诱变育种是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选从大量变异体中筛选出产量高性能优良的突变株。
程序：选择出发菌株—制备孢子或者细胞悬液—诱变剂处理—初筛—复筛。
选择出发菌株：选择有一定生产能力或良好特性的菌株；尽量使用单倍体、单核细胞；尽量使用单细胞悬液或担孢子悬液。 诱变剂及其操作（重点）：凡是能诱发生物基因突变，并且突变频率远远高于自发突变率
的物理因子或者化学物质都称为诱变剂。常用物理诱变剂，紫外线，快中子，X射线，γ射线，化学诱变剂，烷化剂，碱基类似物，脱氨剂等。
紫外诱变的机制与操作要点：能诱发微生物突变的紫外线波长范围是200-300nm最有效波长为253.7nm。机制是导致胸腺嘧啶二聚体的产生。在营养丰富培养基中营养体培养到对数期，孢子培养到刚刚萌发，制备（无菌水或无菌生理盐水）悬液浓度适当（10^6——10^8个/毫升），悬液至于培养皿，在紫外灯管下几十厘米处，去盖，边照边搅拌；处理后将悬液加入到利于正突变体生长的培养基中，取少量菌液涂布于平板培养基上筛选正突变体，紫外照射在暗室中进行，照射后有抑制修复措施，如家异烟肼，低温放1-3h，或用黑纸包裹培养基。
亚硝基胍诱变操作要点：ph6下进行故要磷酸或Tris缓冲液，并加助溶剂；不同微生物处理浓度各异；终止诱变以冷生理盐水稀释50倍以上或低温离心洗涤菌体；接触过NTG的器皿用氢氧化钠或Na2S2O3洗涤。
（交替使用多种诱变剂，或多种诱变剂复合处理更有效；以致死率表示相对剂量） 初筛方法：一般在平板进行，根据形态筛选突变菌株、根据抑菌圈、根据生化反应、浓度梯度法。
营养缺陷型筛选：
营养缺陷型：因丧失合成某种生活必需物质的能力，不能在基本培养基上生长，必须补充它不能合成的营养物质才能生长的一类突变株。是重要的选择标记和育种手段。 三类遗传型个体（重点）：
①野生型：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变之前的原始菌。
②营养缺陷型：野生型菌株经诱变处理后，丧失了代谢途径中某种酶的合成能力，只能在加有该酶合成产物的培养基上才能生长，次类突变菌株成为营养缺陷型菌株。
③原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其在营养要求上与野生型相同。
三种培养基（重点）： 基本培养基（MM）：仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合的培养基。 完全培养基（CM）：可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或班组和培养基。 补充培养基（SM）：只能满足相应的营养缺陷型菌株的生长需要的组合培养基。 筛选方法（重点）：
1.点植法：诱变后的菌悬液涂布字完全培养基上，至长出菌落。后以牙签挑取菌落在一个基本培养基和完全培养基的对应位置点植接种。之后培养这两个新接种的培养皿至长出菌落。若有在对应位置的完全培养基（CM）上长出了菌落而基本培养基上（MM）没有长出菌落，则该菌落为可能是营养缺陷型。
2.夹层培养法：先在培养皿中倒一层不含细菌的MM，冷凝以后加一层含细菌的MM，冷凝后再加一层不含细菌的MM，经培养出菌落后在培养皿底上相应的位置做标记，然后加一层CM再经培养出来的小菌落，多数是在CM生长的营养缺陷型。 营养缺陷型的鉴定：
①鉴定缺陷类别。所加入营养物质为一类营养物质的混合物（多种氨基酸，多种维生素，多种碱基）；
②换用单独的营养物质利用同样的培养过程鉴定是哪种成分的合成能力丧失。
三、代谢控制育种（重点）
代谢控制育种：以诱变为基础，根据代谢控制假设来筛选高产菌种，是一种理性化的诱变筛选策略。它的实质是通过接触代谢途径中的反馈阻遏抑制实现某一产物的大量积累。
基本程序：①了解与产物相关的代谢途径；②提出代谢控制假设（比如某种营养缺陷型可能是高产菌株）；③根据假设进行诱变和筛选试验（并非直接筛选高产菌株）；④验证所筛选到的微生物是否具有高产特性。
（策略：解除反馈抑制或协同反馈抑制等等） 四、原生质体融合和基因组改组育种
原生质体融合：用水解酶去除细胞壁制成原生质体，然后诱导两个亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，最后通过筛选获得集双亲优良性状以一体的稳定融合子。其实质是亲本强制融合。意义在于使两亲株的优良性状集中与重组体内。
（关键问题：高渗溶液如无机盐、糖或糖醇用相应的酶如溶菌酶、纤维素酶等脱去菌体的细胞壁制得原生质体；原生质体在促融剂如PEG或其他方法刺激下发生融合；为了筛选出融合子，两亲本要标记如营养缺陷、抗性、荧光等，通过遗传标记互补选择融合子，工业微生物育种难以找到标记时常用热灭活的方式杀死或钝化其中一个原生质体的亲本，再使两者融合，免去筛选的过程。为什么一亲本被杀死就可以免筛选？） 基因组改组育种：
基因组改组育种是通过人工诱变得到正突变体库，然后将这些正向突变的菌株制成原生质体，进行多亲本递推式融合，从重组体中筛选具有优良性状的菌株。是诱变技术与原生质体融合技术的结合。
四、基因工程育种（略）
国科大研究生课程-生化生产工艺笔记教材
