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实验一 缓冲液配制和pH值测定 实验二 荧光光度法测定核黄素的含量 实验三 茚三酮比色法测定赖氨酸含量
实验四 考马斯亮蓝G-250比色法测定蛋白质含量 实验五 2,6-二氯酚靛酚滴定法测定L-抗坏血酸的含量 实验六 间隔法测定过氧化物酶的活力 实验七 连续记录法测定过氧化氢酶的活力 实验八 纸电泳分离鉴定三种腺苷酸 综合性开放实验
一. 目的
了解配制缓冲液和pH计的基本原理。 掌握配制缓冲液和使用pH计的基本方法。
二. 原理
在一定的酸或碱作用下，能够自动调整和保持溶液pH值基本不变的溶液称为缓冲液。以HAc和NaAc组成的缓冲液为例，它的pH符合下面关系：pH= p Ka ?lg[HAc]/[Ac?]，因此改变[HAc]/[Ac?]的比值，可以在一定范围内配制不同pH值的缓冲液。缓冲液的缓冲容量大小不仅与其总浓度有关，而且与其组分比也有关。总浓度越大，缓冲容量越大；总浓度一定，其组分浓度比越接近1，缓冲容量越大。缓冲液适当稀释或浓缩，其pH值基本保持不变。
测定pH值的pH计（或称酸度计），一般是由一支对H+敏感的玻璃电极和一支不随溶液中被测离子活度变化而改变其本身电位的甘汞电极以及一个测量电位的电位计所组成，两支电极和测试溶液构成一个伏特电池，电极在不同的pH值溶液中产生不同的电位，它符合电化学理论中的Nernst方程，即E = E0?(2.303RT/F)pH。测定中，首先测得已知pH的标准缓冲液中产生的电位Es，然后，由测得未知pH缓冲液中产生的电位Ex通过公式
可直接算出该缓冲液的pH（pHx）。为了方便，pH计上装有一个定位调节器，当测量标准缓冲液pH时，利用它可把读数直
接 指示在标准的pH值上，这样在以后测未知pH的缓冲液时，该电位读数也就直接表示相应的pH值。在本实验使用的Beckman ?61 pH计计中，以上过程均由仪器自动完成。
三. 实验试剂及设备 1. 试剂
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O） 冰醋酸、醋酸钠（NaAc·3H2O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris） 甘氨酸、盐酸、标准pH缓冲液（pH4.01、7.00、10.01）
2. 仪器
电子天平（感量0.001g） pH计
3. 器材
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容 量 瓶： 100mL×2 量 筒：50mL×1 移 液 管： 10mL×1
烧 杯： 100mL?1 200mL?2
漏斗、洗瓶、洗耳球、移液管架、玻棒：各1
四. 操作步骤
1. 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制（0.1mol/L，pH7.0）
(1) 由附录“常用缓冲溶液的配制”表中通过计算，分别称取Na2HPO4·12H2O g，NaH2PO4·2H2O g，用蒸馏水溶解后，定容至100mL。 (2) 将配好的缓冲液倒入试剂瓶，贴上标签，保存备用。
2. 醋酸-醋酸钠缓冲液配制（0.1mol/L，pH5.4）
(1) 0.1mol/L醋酸钠母液的配制：称取NaAc·3H2O g，用蒸馏水溶解后，定容至50 mL。 (2) 0.1mol/L醋酸母液的配制：吸取冰醋酸 mL，用蒸馏水定容至1000mL。
(3) 取0.1mol/L醋酸钠母液43mL，0.1mol/L醋酸7mL，于烧杯中混匀，用pH计测定pH值，使混合液的pH值最终达到5.4。 (4) 将配制好的缓冲液倒入试剂瓶，贴上标签，保存备用。
3. Tris-Gly-HCl缓冲液配制（0.025mol/L，pH8.3 ）
(1) 称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）0.300g，甘氨酸1.44g，加入80mL蒸馏水，加热溶解。 (2) 冷却后，用pH计测定pH值，并不断滴加2.5mol/L盐酸，使pH值最终达到8.3。 (3) 用蒸馏水定容至100mL。
(4) 将配制好的缓冲液倒入试剂瓶，贴上标签，保存备用
五. 思考题
1. 配制缓冲液时，选取合适的缓冲试剂，主要根据什么原则？ 2. 配制缓冲液，常用的方法有哪几种？
一. 目的
了解荧光法测定核黄素的原理和方法。 学习荧光光度计的操作和使用。 二. 原理
原成无色的二氢化物，同时会失去荧光，因而检测样品时要防止荧光的衰减。二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下：
核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物，它在中性或弱酸性的水溶液中为黄色并且有很强的荧光。这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐等还
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图2 核黄素氧化还原机理图
核黄素的激发光波长范围约为440—500nm（一般为440nm），发射光波长范围约为510—550nm（一般为520nm）。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比，可进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。 注意：在所有的操作过程中，要避免核黄素受阳光直接照射。 三. 实验材料及设备 1. 材料 核黄素药片 2. 仪器
荧光光度计 天平（感量0.0001g） 3. 器材
普通试管： 25mL×10 容 量 瓶： 100mL×2(棕色)
移 液 管： 10mL×1 5mL×1 1mL×1 烧 杯： 50mL×2 250 mL×1 滤 纸： f11cm 滴 管：2支
坐标纸、研钵、漏斗、洗瓶、洗耳球、试管架、移液管架、玻棒：各1 四. 试剂的配制
核黄素标准液（5μg/mL）
准确称取核黄素10mg，加100mL浓度为1.71mol/L的醋酸和适量蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。冷却至室温，用蒸馏水定容至2000mL。转入棕色瓶中。五. 操作步骤 1. 样品液的制备
(1) 取样：取核黄素药片一粒，称重 g；转入研钵中磨成粉。 (2) 定容：加0.5mL冰醋酸和适量蒸馏水溶解，用蒸馏水定容至100mL。 (3) 过滤：收集部分滤液于试管中。
(4) 稀释：取滤液2mL于棕色容量瓶中，定容100mL，待测。
（本实验由于样品溶解后所剩残渣很少，残渣所占体积对定容体积100mL造成的误差可以忽略不计，所以采用先定容，后过滤操作过程，这样可以节省时间。）
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2. 标准曲线制作及样品测定 取9支试管，按下表所示顺序操作。
注意: 在测定中如果待测样品溶液的荧光强度超出100%，则需要再行稀释，并记录稀释倍数或调节灵敏度。 六. 结果处理
1. 由1～6号管的数据，以核黄素含量(mg)为横坐标，F值（F1-F2）为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线； 2. 求样品管F的平均值；
3. 由从标准曲线中求样品管中核黄素的含量(μg)；
4. 计算你所取生物材料中核黄素的含量（单位用μg/g鲜重）。 七. 思考题
为什么在核黄素的整个测定过程中，需要避光操作？ 附注（荧光光光度计使用说明）
使用930型荧光光度计时：核黄素荧光测定的激发光波长为440nm，发射光波为520nm。因此可选用带通型400nm（蓝字）滤色片为激发光滤色片，选用截止型510nm（红字）滤色片为发射光滤色片。
待仪器预热并调好零点后，用参比溶液调荧光光度计的荧光强度读数到满刻度（100%），然后分别测定其它溶液的相对荧光强度F值。 使用F96型荧光光度计时：需用“0”管的溶液调F=0.00，再分别测定其它的中溶液的F值。 一. 目的
了解赖氨酸总含量的测定方法。
掌握用比色法测定谷物类样品中赖氨酸含量。 二. 原理
亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，它仅有的一个氨基（a-NH2）相当于蛋白质中赖氨酸残基上的e-NH2，因而可以用亮氨酸标准液制作标准曲线来测定蛋白质中赖氨酸的含量。但计算浓度时必须乘上两种氨基酸的分子量之比（赖氨酸与亮氨酸分子量之比为1.11:1）。
蛋白质中的赖氨酸残基上具有一个游离的e-NH2，它与茚三酮起颜色反应呈蓝紫色，在波长570nm处其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸残基的含量成线性关系。
式中 W：样品质量
C ：样品中游离氨基酸的量，各种作物种子中游离氨基酸的含量大约是：玉米：0.01%，高粱：0.04%，水稻：0.01%，小麦：0.05% X ：从标准曲线查得的赖氨酸的质量
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三. 实验材料及设备 1. 材料 玉米粉 2. 仪器
分光光度计 分析天平 恒温水浴 3. 器材
刻度试管： 25mL×11
移 液 管： 1mL×1 2mL×2 20mL×1 烧 杯： 250mL×2 50mL×1 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 滤 纸： f11cm
研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1 四. 试剂的配制
1. 柠檬酸缓冲液（0.2mol/L，pH5.6）(参见附录二) 2. 茚三酮试剂
称3g茚三酮溶于100mL 95%乙醇中，溶解后加入160mg二氯化锡，搅拌溶解后加入100mL柠檬酸缓冲液中，搅匀备用。 3. 亮氨酸标准液（50mg/mL）
准确称取5mg亮氨酸，用蒸馏水稀释定容到100mL，则得浓度为50mg/mL的标准液。 五. 操作步骤 1. 样品液的制备
(1) 取材：称取烘干、粉碎（过80目筛）的玉米粉0.3g（油料种子须经脱脂处理）。
(2) 提取：将称取的样品放入试管，准确加入20mL蒸馏水，摇匀。读取样品悬液的总体积 mL，置于80℃恒温水浴中提取20min。（可间歇摇动） (3) 定容：冷却后，用蒸馏水将试管中悬液定容至（2）中悬液总体积刻度 mL,，即最终样品液总定容体积仍为20mL，摇匀。
(4) 过滤：将提取液用滤纸过滤，收集滤液作为待测样(滤纸不能用蒸馏水湿润)。 2. 标准曲线制作及样品测定
取9支刻度试管，按下表所示顺序操作。
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六. 结果处理
1. 由0～6号管的数据，以亮氨酸含量(mg)为横坐标，A570为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线； 2. 求样品管A570的平均值570；
3. 由530从标准曲线中求样品管中赖氨酸的含量(mg)；
4. 计算你所取生物材料中赖氨酸的含量（单位用mg/mg样重）。 七. 思考题
1. 能否运用线性回归方程的方法，计算样品中赖氨酸的百分含量？
2. 运用本实验方法测定含油份高的作物种子时，为什么对样品要进行脱脂处理？ 3. 分析本实验中可能引入误差的几个关键环节。 一. 目的
学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。 二. 原理
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，其结构如下图。它在游离状态下最大吸收波长为464nm。
595nm。这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。
为5mg，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是实验室常用的蛋白质定量方法。但染料易吸附在比色杯上而造成误差，每次更换检测样液时，应及时用乙醇洗涤比色皿，再用蒸馏水冲洗残留的乙醇。 三. 实验材料及设备 1. 材料 包心菜 2. 仪器
分光光度计 离心机 电子天平 3. 器材
刻度试管： 25mL×9 刻度试管： 10mL×1
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由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为
在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定。该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量
南京农业大学考研生化试验
