第29卷第2期2020年4月
CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY
中国组织化学与细胞化学杂志
Vol.29.No.2April.2020
OLN-93细胞系分化条件探讨
周颖1，苏敏1，杰吉甫2，符辉1*
（1武汉大学基础医学院人体解剖和组胚胚胎学系，武汉 430031；2新疆巴音郭楞蒙古自治州卫生学校解
剖学系，库尔勒 841000）
〔摘要〕目的 OLN-93细胞是实验室常用的少突胶质前体细胞细胞系，多被用于研究少突胶质细胞的分化。本文来探讨OLN-93细胞系的最佳分化条件。方法 分别用DMEM、DMEM+三碘甲状腺原氨酸(T3)、DMEM+T3+N2、DMEM/F12、DMEM/F12+T3、DMEM/F12+T3+N2等6种不同培养基条件对OLN-93细胞系进行分化处理，于处理后的第3d和第6d观察细胞形态变化并通过免疫荧光技术鉴定细胞分化情况，同时通过检测髓鞘主要标志物MBP、CNP基因的mRNA和蛋白质的表达情况来分析细胞的分化状态，从而筛选出OLN-93细胞的最优分化培养基。 结果 比较OLN-93细胞在6种不同条件下的分化情况，免疫荧光、qPCR 和Western Blot检测显示出基本一致的结果，DMEM培养基中的细胞分化状态最好，其次为DMEM+T3组，而DMEM+T3+N2和DMEM/F12+T3+N2组最差。结论 DMEM培养基为适宜OLN-93细胞生长分化的最佳培养条件，其他成分如F12、N2均会不同程度的抑制细胞的分化。我们实验发现OLN-93已经丧失了对T3的反应，这一点在使用OLN-93细胞的实验研究中需要加以考虑。
〔关键词〕OLN-93细胞；少突胶质细胞；分化；三碘甲状腺原氨酸
〔中图分类号〕R-331 〔文献标识码〕A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2020. 02. 004
Study on the optimal differentiation culture media for OLN-93 cell culture
Zhou Ying1, Su Min1, Jie Jifu2, Fu Hui1*
(1 Department of Human Anatomy and Histo-Embryology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430071, China;
2
Department of Anatomy, Health School of Bayinguoleng Mongolian Autonomous Prefecture, Korla 841000, China)
〔Abstract〕Objective To explore the optimization of the differentiation media for OLN-93, a common oligodendrocyte precur-sor cell line widely used to study the differentiation of oligodendrocytes in labs throughout the world. Methods OLN-93 cells were differentiated with 6 different media DMEM, DMEM+ triiodothyronine (T3), DMEM+T3+N2, DMEM/F12, DMEM/F12+T3, and DMEM/F12+T3+N2. 3 days and 6 days after treatment (D3 and D6) were used as 2 time points to observe the cell morphological changes and for further measurement. Immunofluorescent staining, qPCR and western blot techniques were used to detect myelin gene (MBP and CNP) expression to analyze the cell differentiation status. And thus the optimal differentiation medium for OLN-93 cells was determined. Results Comparing the differentiation status of OLN-93 cells under 6 different conditions, immunofluorescence, qPCR and Western Blot detection showed generally the same results. The best cell differentiation status of OLN-93 cell was obtained in DMEM medium, followed by DMEM+T3. While the cell differentiation status in DMEM+T3+N2 and DMEM/F12+T3+N2 groups was the worst. Conclusion DMEM medium is the best culture medium for OLN-93 growth and differentiation. Both F12 and N2 inhibit OLN-93 cell differentiation. OLN-93 cells have lost their responses to T3 differentiation signal. This fact should be considered in OLN-93 experiments.
〔Keywords〕OLN-93; oligodendrocytes; differentiation; triiodothyronine
少突胶质细胞（oligodendrocytes, OLs）是中枢
〔收稿日期〕2020-01-06 〔修回日期〕2020-04-10〔基金项目〕武汉市科技局应用基础研究计划
（2017060201010168）；国家级大学生创新创业项目（S2018301759）
神经系统的成髓鞘细胞，起源于胚胎神经管的神经上皮细胞。在中枢神经系统（central nervous system, CNS）中，成熟的OLs包绕轴突形成绝缘的髓鞘，是神经电信号高效传递的结构基础，还为轴突提供代谢和营养支持[1]。在自身免疫、感染等病理条件下，OLs易损伤变性导致髓鞘板层分离、断裂、崩
〔作者简介〕周颖，女（1993年），汉族，硕士研究生
*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：hueyfu@hotmail.com
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解进而完全脱失，随后轴突变性 [2]，临床上脱髓鞘疾病以多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）最为多见。研究髓鞘再生的相关机制对于治疗脱髓鞘疾病有重要理论指导意义，而建立体外少突胶质细胞分化的模型是研究髓鞘发育和再生的重要前提条件。
OLN-93是从大鼠脑胶质细胞中获得的一种永生化少突胶质前体细胞系[3]，与直接从动物体获取的少突胶质前体细胞（OPC）相比，其易于培养和维护，可一次性获得大量细胞。改变条件可以在体外诱导其分化，表达MBP（myelin basic protein）、MAG（myelin associated glycoprotein）、PLP（proteolipid protein） 等髓鞘蛋白，很好的模拟少突胶质细胞的分化成熟过程。因而OLN-93细胞系是用于研究髓鞘发育和再生的常用的体外细胞培养模型。
OLs分化成熟过程十分复杂，在此过程中细胞形态发生明显变化：随着细胞的分化成熟，细胞出现形态变化，形成双极突起，之后分支分叉增多形成多级突起，随之突起之间节点相互交织形成致密的网状，细胞体积也逐渐增大。与此同时细胞膜中标志性蛋白如CNP、MBP等的表达水平也改变，检测这些形态学和分子标记物的动态变化可以对OL分化的各阶段进行鉴定[4,5]。以前的报道中显示，OLN-93的分化过程类似于OLs。但是以往的研究往往采用不同的培养条件等来诱导OLN-93的分化过程。我们的研究中发现不同的条件下，
OLN-93分化情况不尽相同。F12培养基、N2添加物和三碘甲状腺原氨酸（T3）[6-8]都是在OPC体外培养液中常见的成分，对OPC的存活和分化有促进作用。我们在本实验室检测它们在OLN-93细胞培养的效果并与OPC培养进行对比。通过本研究希望能够优化OLN-93的分化条件，最大程度上模拟少突胶质细胞的分化成熟过程。
材料与方法
1 主要药品及试剂
DMEM高糖培养基、DME/F12培养基和热灭活胎牛血清购自美国Hclone公司，三碘甲状腺原氨酸（T3）购自美国Sigma公司，神经营养因子N2购自美国Gibco公司，小鼠单克隆抗体Anti-髓鞘碱性蛋白（MBP）和小鼠抗 2’，3’-环核苷酸 3’-磷酸二酯酶（CNP）单克隆抗体购自Calbiochem公司，兔
抗Olig2多克隆抗体由美国哈佛大学Charles Stiles 教授馈赠，Alexa Flour 555 标记的山羊抗小鼠 IgG购自life公司，Alexa Flour 488 标记的驴抗兔 IgG 二抗来自美国Proteintech公司。DAPI封片剂购自SouthernBiotech公司。2 实验细胞
大鼠OLN-93细胞系为浙江大学赵经纬教授馈赠。
3 OLN-93细胞培养
OLN-93细胞正常培养用DMEM高糖培养基中补充10%热灭活胎牛血清（FBS）于37℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，每2~3天更换培养液。传代后，在正常培养基中培养2d，然后分别培养于DMEM、DMEM+T3、DMEM+T3+N2、DME/F12、DME/F12+T3、DME/F12+T3+N2培养基进行分化，观察细胞生长情况并拍照记录。4 实时定量 PCR
收集分化培养3d和6d的OLN-93细胞，利用Trizol试剂提取细胞的总RNA后，用NanoDrop2000检测RNA浓度和质量。用2.5μg总RNA在42℃ 60min的条件下逆转录成cDNA。实时定量PCR 引物序列见表1，扩增条件为：94℃ 10s，64℃ 20min，72℃15s共40个循环。实时定量PCR以GAPDH作为内参，结果用2-ΔΔCt方法进行分析。反应结束后用1.0% 琼脂糖凝胶电泳来确认反应结果为单一PCR 产物。
表1 PCR引物序列
Tab. 1 Sequences of primers for PCR
Target genePrimer
MBP
5’-GCAGCCAGCACCACTCTTGA-3’5’-CAGCCGAGGTCCCATTGTTC-3’
CNP5’-TTTACCCGCAAAAGCCACACA-3’5’-CACCGTGTCCTCATCTTGAAG-3’GAPDH
5’-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’
5 细胞免疫荧光染色
在细胞培养的第3d和第6d，对细胞行OLIG-2、CNP、MBP免疫荧光染色，DAPI封片剂最后对细胞进行核染色。具体染色过程：收集24孔板细胞，PBS清洗3次后用95%的乙醇固定30min，染色前
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PBS漂洗3次；用Triton X-100室温破膜15min、封闭液室温封闭1h后分别孵育小鼠抗 CNP、大鼠抗 MBP 与兔抗 Olig2 一抗，次日 PBS 清洗5 min×3，分别加入 Alexa Flour 488 标记的山羊抗小鼠 IgG与双标染色，倒置荧光显微镜下观察并拍照记录，统计 CNP和 MBP阳性细胞数量。6 Western blot
收集OLN-93细胞提取全细胞蛋白，用BCA法对蛋白浓度定量后进行变性还原聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，转至 PVDF 膜后用5%的脱脂牛奶或BSA室温封闭1h。之后分别加入小鼠抗 MBP（1﹕1000）、小鼠抗CNP单克隆抗体（1﹕1000）和小鼠抗 β-actin（1﹕10000），4℃过夜。次日，用 TBST 冲洗3次，室温孵育辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗1h，再用TBST洗膜3次后用ECL显色液曝光显影，使用发光成像仪自动曝光捕捉，Image J 软件进行光密度分析。以蛋白β-actin 的表达量为内参，计算目的蛋白相对表达量。7 观察指标
OLN-93细胞在不同分化阶段不同培养条件下，
数目及形态学变化，CNP和MBP的mRNA和蛋白CNP和Olig2质的表达水平以及荧光显微镜下MBP、的阳性情况。
8 统计学分析
所有实验结果都重复3次或以上。实验结果用 Graphpad Prism 5软件进行统计学分析和图像制作。所有数据以均值±标准差（?x±s）表示，计量资料
Alexa Flour 594 标记的山羊抗兔 IgG 二抗（1﹕500）采用方差分析。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。
结 果
1 DMEM培养使OLN-93细胞分化成CNP+或MBP+细胞数量居多
OLN-93细胞在各种分化条显微镜下观察发现，
件下其外形无明显差异表面突起少，膜面积无明显增加（图1、图2），与少突胶质细胞原代培养分化不尽相同。但是在分化培养后，免疫荧光染色显示OLN-93细胞表达CNP和MBP（图1 、图2），且超过99%的细胞都呈少突胶质细胞标志蛋白Olig2阳性（数据未显示）。
我们对OLN-93细胞在各种不同分化条件下进行分化处理，第3d进行CNP+细胞占总细胞比例的检测，第6d进行MBP+细胞比例的检测，结果显示：与其他5组相比，DMEM培养基中CNP和MBP阳MBP+细性细胞比例最高（CNP+细胞98.29±0.37%，胞 97.43±1.22%），DMEM/F12+T3+N2组CNP阳性率最低（92.49±1.53%），而DMEM +T3+N2组MBP阳性率最低（86.40±3.74%）(图1、图2)。实验显示T3和N2对OLN-93细胞的分化有抑制作用。
图1 不同分化条件对OLN-93细胞内CNP表达影响的免疫荧光检测（DAPI复染细胞核）。A，DMEM；B，DMEM+T3；C，DMEM+T3+N2；D，DMEM/F12；E，DMEM/F12+T3；F，DMEM/F12+T3+N2；标尺，50μm
Fig. 1 Immunofluorescence examination for the effect of different differentiation conditions on CNP expression in OLN-93 cells (DAPI counterstaining of nuclei). A, DMEM; B, DMEM+T3; C, DMEM+T3+N2; D, DMEM/F12; E, DMEM/F12+T3; F, DMEM/F12+T3+N2; scale bar, 50μm
OLN-93细胞系分化条件探讨
