目的：
验证X-pPR3-N、Y-pPR3-N和Bait-pBT3-STE，是否为相互作用的关系。
方法：
将构建到pPR3-N载体上的X、Y基因及构建到pBT3-STE的Bait基因，通过共转的方法转化至酵母菌株NMY51，确定X-pPR3-N、Y-pPR3-N和Bait-pBT3-STE是否为相互作用的关系。
材料：
1. 诱饵克隆：X、Y-pBT3-STE
猎物克隆：Bait-pPR3-N 2．载体：pBT3-STE、pPR3-N 3．Clontech酵母双杂交系统 4．培养基：
1). 酵母完全培养基：
YPDA：1% Yeast extract，2% Tryptone，2% Glucose, 0.02% Adenine。 2). 酵母缺陷型筛选培养基：
参照Clontech公司的PT3024-1/Yeast Protocols Handbook。其中各种培养基分别以下列符号表示：
SD-TL：-trp, -leu； SD-TLH：-trp, -leu, -his； SD-TLHA：-trp, -leu, -his, -ade。 3). 其他贮备液：
10 × TE：0.1 M Tris-HCl（pH7.5），10 mM EDTA，高压灭菌； 10 × LiAc：1 M LiAc (pH7.5)，高压灭菌；
第一部分 将质粒转化受体菌NMY51中
1.1酵母转化
将以下质粒分别转入NMY51中： Reaction
1 2 3 4 5 6
1.2 酵母转化方法
1.从YPDA平板挑取NMY51单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5。
2.转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6-0.8。
3.离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
4.用20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 5.用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 6.用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，每个50 ul（每个转化），备用。
7.每个1.5 ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350
240 ul
8. 30℃水浴孵育，30 min。
1 M LiAc 36 ul
ssDNA (20 mg/ml)
5 ul
质粒DNA 各5 ul
pPR plasmid X-pPR3-N Y-pPR3-N pPR3-N X-pPR3-N Y-pPR3-N pPR3-N
pBT plasmid Bait-pBT3-STE Bait-pBT3-STE Bait-pBT3-STE pBT3-STE pBT3-STE pBT3-STE
涂板种类 SD-TL SD-TL SD-TL SD-TL SD-TL SD-TL
备注 实验组 实验组 对照组 对照组 对照组 对照组
9. 42℃水浴热激，25 min。 10.30℃水浴复苏，30 min。
11.离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
12.每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。 13.30℃恒温培养4天 1.3 检测结果
从实验组X-pPR3-N和Bait-pBT3-STE、Y-pPR3-N和Bait-pBT3-STE，对照组pPR3-N和Bait-pBT3-STE、X-pPR3-N和pBT3-STE、Y-pPR3-N和pBT3-STE、pPR3-N和pBT3-STE，共转NMY51长出的酵母转化子随机各挑取了8个单菌落进行PCR检测并保菌。从PCR检测正确的单菌落中随机各挑取1个进行点板。
图1. 检测结果
pBT3-STE-Bait的筛选压力为20mM 3AT
由图中可知，从实验组X-pPR3-N和Bait-pBT3-STE在SD-TLHA+10 mM 3AT、SD-TLHA+20 mM 3AT板上不生长,因此X-pPR3-N和Bait-pBT3-STE可能不发生互作关系；实验组Y-pPR3-N和Bait-pBT3-STE在SD-TLHA+20 mM /30mM/40mM 3AT板上生长，并且点板验证的筛选压力超过了pBT3-STE-Bait自激活的验证的20mM浓度，因此实验组Y-pPR3-N和Bait-pBT3-STE是互作的，并且互作强度较强。
膜酵母双杂交一对一验证结题报告模板
