酵母膜系统文库构建与筛选技术

DUAL membrane 系统的背景

DUAL membrane 系统(DUAL membrane system)首先由瑞士的Dualsystems Biotech AG 公司开发出来，是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统，泛素可以分成两部分表达，即其N端部分(NubI)和C端部分(Cub)，后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白体系，断裂的泛素的两部分分别连接一个蛋白，且两个蛋白之间存在相互作用。它提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法，使得分析膜蛋白间的互作成为现实。 技术特点

可以进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究。它既可以用于表达文库的筛选，也可以应用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的验证。 膜系统原理

1、泛素(ubiquitin)可以分成两部分：N端(Nub)和C端(Cub)；

2、Nub与Cub有很强的亲和力，当在同一细胞同时表达时，Nub与Cub会结合形成完整的泛素，会被泛素蛋白酶(UBPs)识别并切割；

3、Nub第三位的异亮氨酸突变成甘氨酸后(NubI→NubG)，Nub与Cub的亲和力大大降低。

4、Cub融合转录因子LexA-VP16，诱饵构建在Cub上，猎物构建在NubG上； 5、当诱饵与猎物互作，使得Cub与NubG靠近而形成完整的泛素，UBPs识别并切割；

6、被切下的转录因子LexA-VP16 进入核内，启动报告基因(His，Ade，LacZ)

的表达。

独具技术优势

?在体内原位检测蛋白-蛋白间的相互作用而无需核定位信号

?使用小的泛素结构域(NubG/Cub)使得相互作用蛋白质之间的空间位阻最小化 ?蛋白间的互作信号靠泛素特异性结合蛋白(UBPs)剪切人工转录因子(LexA)启动，而不是靠转录，因此可以检测蛋白自身的转录激活或抑制序列

?此体系可以用来研究两个膜蛋白的相互作用和一个膜蛋白与一个胞质蛋白的相互作用

?任何一种膜蛋白都可以作为诱饵，能使与待检测蛋白融合的相互作用模块(Cub-PLV-NubG)定位在细胞质内 诱饵载体的选择方式

注：若N端和C端都位于胞外，可截短使得C端出现位于胞内段，再选择相应载体

应用前景

该技术可以解决信号转导通路，离子通道，受体，细胞增殖分化，病毒侵染宿主等许多重要的生物学问题，也可以设计药物，为发现新药寻找到合适的生物靶标。

项目方案设计 目的：

发现pBT3-SUC-xx的相互作用蛋白

N-terminal 胞内（inside） 胞外（outside）且含信号肽 胞外（outside）不含信号肽 胞内（inside） C-terminal 胞外（outside） 胞内（inside） Vector pBT3-N pBT3-SUC 方

法：

以构建到pBT3-SUC载体

胞内（inside） pBT3-STE 胞内（inside） pBT3-N或pBT3-STE 上的

xx基因为诱饵，筛选酵母双杂交小鼠文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA

测序和BLAST比对分析，确定与pBT3-SUC-xx相互作用的蛋白。

材料：

1．诱饵克隆：pBT3-SUC-xx 2．诱饵载体：pBT3-SUC 3．文库酵母质粒：小鼠

4．分离泛素介导的酵母双杂交系统

5．培养基：

1). 大肠杆菌培养基：

LB：0.5% Yeast extract，1% Polypeptone，1% NaCl。 2). 酵母完全培养基：

YPDA：1% Yeast extract，2% Tryptone，2% Glucose, 0.02% Adenine。 3). 酵母缺陷型筛选培养基：

参照Clontech公司的PT3024-1/Yeast Protocols Handbook。其中各种培养基分别以下列符号表示：

SD-L：-leu；SD-TL：-trp, -leu；SD-LH：-leu, -his；SD-TLH：-trp, -leu, -his；SD-TLHA：-trp, -leu,-his, -ade。

4). 其他贮备液：

10×TE：0.1 M Tris-HCl（pH7.5），10 mM EDTA，高压灭菌； 10×LiAc：1 M LiAc (pH7.5)，高压灭菌；

第一部分诱饵基因跨膜结构预测

1.1信号肽预测

所用网站：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

结果：N端含有信号肽。 1.2跨膜结构预测

所用网站：https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html

结果：471-491氨基酸在膜上，1-470在胞外，492-1012在胞内。选择pBT3-SUC载体进行构建。

第二部分诱饵基因载体构建

2.1基因扩增：

2.2重组产物验证：

2.3测序结果：

AATCAGATATAT………….

第三部分将诱饵质粒转化受体菌NMY51中及其自激活检测

3.1酵母转化

将以下质粒分别转入NMY51中：

Reaction

1 2

3.2 酵母转化方法

1. 从YPDA平板挑取NMY51单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5。

2. 转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6。

3. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。

4. 用20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 5. 用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 6. 用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，每个50 ul（每个转化），备用。

7. 每个1.5 ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。

50%PEG3350

240 ul

8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏，30 min。

11. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。

1 M LiAc 36 ul

ssDNA (20 mg/ml)

5 ul

质粒DNA 各5 ul

plasmid pBT3-SUC-XX pBT3-SUC

涂板种类 SD-L SD-L

备注 筛库备用&

自激活检测 阴性对照

12. 每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。 13. 30℃恒温培养4天。 3.3自激活检测

pBT3-SUC-XX、pBT3-SUC转化到NMY51，涂到SD/-Leu平板，30℃恒温培养3-5 d。随机挑取6个点用pGBKT7的载体引物进行PCR验证，随机取了三个正确的克隆点板至对应的不同浓度（0、5、10、20、30、40、50、60、70 mM）3AT的缺陷型平板上，30℃恒温培养3天。3AT是酵母HIS3蛋白合成的竞争性抑制剂，用于抑制HIS3基因的泄漏表达。

结果如下：

图1. 自激活检测结果

从图中看出40 mM浓度下还有少量的菌长出，而50 mM浓度下没有菌生长。 结论：选用50 mM 3AT进行后续筛库浓度。

第四部分文库筛选

用含有pBT3-SUC-XX诱饵质粒的NMY51酵母菌株作为受体菌制备感受态，将小鼠文库质粒转入其中，涂布于含50 mM 3AT的SD-TLHA筛选平板。 4.1文库DNA转化方法：

1. 从SD-L平板挑取单菌种接于液体SD-L培养基50 ml，30℃，225 rpm，振荡培养24 h。 2. 转接于YPDA液体500 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6。 3.离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。

4.用30 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 5.用20 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 6.用10 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清。 7.向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。

50%PEG3350 1 M LiAc ssDNA (10 mg/ml) 文库质粒DNA

9.6 ml

8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏1 h。

11.离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清，用6 ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20 ul培养物稀释后涂SD-TL平板，用于检测文库转化效率。其余涂50 mM 3AT的SD-TLHA平板10块。

12. 30℃恒温培养3-7天，观察菌落生长。

1.44 ml

300 ul

25 ug

第五部分酵母阳性克隆鉴定及测序比对

为了鉴定50 mM 3AT的SD-TLHA平板中筛选到的阳性克隆分别是什么基因，需要将这些阳性克隆从酵母细胞中扩增出来进行DNA测序，并与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析。

注：扩增阳性克隆使用的是南京瑞源生物技术有限公司自主研发的一款快速扩增酵母阳性克隆试剂盒(Yeast Colony Rapid Detection Kit，货号：RY8001)。

测序比对结果

第一次挑选96个阳性酵母克隆，全部PCR扩增，有条带的54个，测序成功44个，经过Seqman、BLAST比对，去除空载和重复序列最终获得39个不同的序列。结果表明它们分别属于39种不同的蛋白编码基因。（BLAST结果见附件）

第二次挑选96个阳性酵母克隆，全部PCR扩增，有条带的44个，测序成功31个，经过Seqman、BLAST比对，去除空载和重复序列最终获得24个不同的序列。结果表明它们分别属于24种不同的蛋白编码基因。（BLAST结果见附件）

第六部分酵母阳性克隆回转验证

将上述划线于50 mM 3AT的SD-TLHA平板上长出的阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点至SD-TL、50 mM 3AT SD-TLH、50 mM 3AT SD-TLHA平板，30℃恒温培养3-4天。 结果如下：

图2. 两次筛库回转验证结果（第一次图上，第二次图下）

回转验证结果：

筛选得到的63个酵母阳性克隆，其中61个能在SD-TL缺陷型平板上正常生长，61个能在50 mM 3AT SD-TLH平板上正常生长，61个能在50 mM 3AT SD-TLHA平板上生长。

膜系统文库常见问题

1. 酵母双杂实验过程中如何选择核体系或者膜体系？ 主要是根据所关注的诱饵蛋白在细胞内的定位情况来确定： 1) 诱饵基因是定位在膜上的蛋白，则选择膜体系文库； 2) 诱饵基因是定位于核，则选择核体系文库；

3) 诱饵基因是定位在细胞质，可以选择核体系或者膜体系文库 2. 分离泛素膜系统的优点有哪些？缺陷有哪些？ 分离的泛素系统优点

研究的蛋白质之间的相互作用发生在细胞膜或细胞质，而不是细胞核中 , 因此使得在细胞质和细胞膜中行使生理功能的蛋白质相互作用的研究得到广泛的应用， 在一定程度上弥补了传统的酵母双杂交系统的缺陷。

报告蛋白也可以选用其他性质的蛋白 (如酶) ，这样就可以通过检测酶活性来分析蛋白质间的相互作用。 分离的泛素系统的局限

在文库筛选结合蛋白时通常存在着假阳性较高的缺陷。因此，用该系统筛选出来的相互作用蛋白尚需采用免疫共沉淀等方法进一步加以证实； 3. 膜系统酵母双杂文库如何选择诱饵载体？

膜系统酵母双杂根据诱饵基因的蛋白跨膜方式选择不同的载体，可以根据如下网站预测蛋白结构进行选择：

http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius/ http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/

上面的这两个网站可以分析膜蛋白的细胞内和细胞外区域。 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

这个网站可以具体分析蛋白的信号肽序列，以及N端是否存在cleavge site。

南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。