D21S11稀有等位基因落入相邻基因座1例
陆慧洁，陈 玲，邱平明 （南方医科大学基础医学院法医学系，广东 广州 510515）
【期刊名称】法医学杂志 【年(卷),期】2016(032)003 【总页数】2
【关键词】法医遗传学；等位基因；短串联重复序列；三带型 【文献来源】
https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_journal-forensic-
medicine_thesis/020124644304.html
1 案例
1.1 简要案情
建立基因档案，送检血液样本一份。 1.2 初次检验
采用 Chelex-100法提取 DNA，AmpFeSTR? SinofilerTM试剂盒（美国AB公司）进行PCR复合扩增，扩增体系和热循环反应按试剂盒说明书进行，扩增产物在3130xl遗传分析仪（美国AB公司）电泳，Genemapper ID v3.2软件分析结果。D21S11基因座表现为纯合子，D7S820基因座显示为5/8/11三带型，其中等位基因5的峰高略低于等位基因8和11的峰高（图1）。 1.3 复核检验
采用Chelex-100法提取DNA，GoldeneyeTM20A试剂盒［基点认知技术（北京）有限公司］进行PCR复合扩增，扩增体系和热循环反应按试剂盒说明书进行，扩增产物在3130xl遗传分析仪电泳，Genemapper ID v3.2软件分
析结果。参考Kline等［1］发表的D21S11基因座引物序列（F：5′-CCAGCTTCCCTGATTCTTCA-3′；R：5′-CACTGAGAAGGGAGAAACACTG-3′）进行单基因座扩增，扩增反应体系含12.5μL 2×Go Taq? Green Master Mix（美国Promega公司），正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板20 ng，加超纯水至总体积为25 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，32个循环；72℃ 5min，4℃保存。PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶（T=6%，C= 3.3%）电泳，硝酸银染色显带，56℃干胶过夜。从凝胶上剪下两条目的等位基因条带（包括标识峰条带和未标识峰条带），分别加入50μL超纯水浸泡24h以上，吸取浸泡液再次进行单基因扩增，扩增体系总体积为50 μL，含2×Go Taq?Green Master Mix 25 μL，正、反向引物（10μmol/L）各2μL，等位基因浸泡液21μL，引物序列和热循环反应条件同上。将上述PCR扩增产物和引物序列送上海美吉生物医药科技有限公司广州分公司进行序列测定。采用Chromas v1.62软件（澳大利亚Technelysium公司）查看测序图谱，用BioEdit Version 5.0.9软件（加拿大Ibis Biosciences公司）比对测序结果。
结果显示，绿色荧光标记的D7S820基因座分型为8/11，蓝色荧光标记的D21S11基因座与D18S51基因座之间出现一个未标识的峰（图2），根据片段长度将该等位基因判读为40.3。单基因座扩增结果如图3A所示，D21S11基因座检出两条等位基因条带。目的等位基因测序结果，等位基因32的重复序列［TCTA］6［TCTG］5［TCTA］3TA［TCTA］3TCA［TCTA］2TCCATA ［TCTA］13与STRBase［2］相同，核心序列为TCTA与TCTG，重复序列中间有固定TA、TCA与TCCA的插入；稀有等位基因40.3的重复序列为［TCTA］
5［TCTG］6［TCTA］3TA［TCTA］3TCA［TCTA］2TCCATA［TCTA］4TCA［TCTA］2TCCATA［TCTA］12TATCTA，与等位基因32相比，在第23个重复序列下游插入TCA［TCTA］2TCCATA［TCTA］12TATCTA（图3B）。
2 讨论
正常情况下，人常染色体一个STR基因座上有两个等位基因，纯合子图谱表现为只有1条带或1个峰，杂合子图谱表现为2条带或2个峰。在实际案件检测中，单个STR基因座的分型图谱有时会出现3条带或3个峰的情况，这一现象被称为三带型（three-banded pattern）［3］。三带型包括 Type1和Type2两种类型，Type1表现为其中两个峰的峰高之和约等于另一个峰，Type2表现为三个峰的峰高接近［4-5］。该案例用SinofilerTM试剂盒检测时，D7S820基因座表现为三带型，但其等位基因5的峰高较等位基因8和11低，且与D21S11基因座的等位基因32接近，不属于上述两种典型的三带型类型。这种情形提示可能D21S11出现一个较大的稀有等位基因落在D7S820基因座等位基因梯度标准物（ladder）范围内，并被分析软件自动判读，导致D7S820基因座出现假三带型。
在STR分型中常会遇到未被等位基因梯度标准物（ladder）所包含的新的等位基因，这被称为分型标准物外（off-ladder allele，OL）等位基因或稀有等位基因［6］，其产生的原因一方面是由于电泳过程中发生漂移，另一方面原因是重复序列插入或缺失形成的复合结构。目前，已有文献报道［7-9］，由于OL等位基因过大或过小落在相邻的基因座ladder范围内，分析软件错误标识或判读稀有等位基因，形成假“三带型”等位基因。因此，该案例用GoldeneyeTM20A试剂盒复核检测，结果显示D7S820基因座分型为8/11，
D21S11基因座分型为32和D21S11与D18S51基因座之间的一个未标识峰；单基因座扩增验证结果显示D21S11基因座有两条等位基因条带；D21S11基因座基因测序结果证实了GoldeneyeTM20A试剂盒中的未标识峰是D21S11的稀有等位基因40.3，而在SinofilerTM试剂盒中被自动判读为D7S820的等位基因5。因此，在判读三带型时要观察等位基因峰高，并与相邻基因座的等位基因峰高进行对比，特别是软件自动读出三带型的情形下，极易发生误判。 OL等位基因片段长度过大或过小落入相邻基因座 ladder范围内的现象在 D13S325、D2S1338、 D3S1358等基因座也有报道［9-11］，所以峰高是DNA图谱分析必不可少的一个观察要素。实际检案对于可疑等位基因峰，需采用其他试剂盒进行复核验证，必要时进行单基因座扩增验证后序列测定。上述案例显示的稀有等位基因超出ladder范围，且落入同色荧光的相邻基因座ladder范围内，可造成两个基因座同时错误分型，所以对这种异常的OL等位基因要特别关注和识别。 参考文献：
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［J］.Forensic Sci Int Genet，2012，6（1）：108-112. （本文编辑：柳 燕）
doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.024 【文献来源】
https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_journal-forensic-
medicine_thesis/020124644304.html
D21S11稀有等位基因落入相邻基因座1例
