山药花青素合成关键酶基因的解析
殷剑美,王 立,张培通,韩晓勇
【摘 要】测定了紫山药和白山药叶、茎、块茎中的花青素含量、积累量和积累速率,以及花青素合成酶基因PAL、F3H、DFR、ANS和UFGT的实时表达。结果表明：除了DFR基因外其他基因在山药幼嫩组织中的表达水平更高；所有基因在紫山药块茎中的表达水平较高；ANS和UFGT在紫山药中高度表达,而在白山药中低表达或不表达;块茎中花青素的动态积累量呈一个典型的双“S”曲线;PAL和F3H基因只在花青素积累速率最快之前的块茎膨大初期高度表达,而DFR、ANS和UFGT表达水平的两个高峰期与花青素积累速率的两个高峰期符合。推测控制紫山药颜色的关键酶基因可能是ANS和UFGT或两者之一。 【期刊名称】江西农业学报 【年(卷),期】2018(030)007 【总页数】6
【关键词】花青素;合成酶；基因;紫山药；白山药
基金项目：江苏省农业科技自主创新基金项目[CX(16)1019]。
花青素是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素,它不仅可以使花朵和果实呈现鲜艳的颜色而具有观赏价值,有利于吸引昆虫和食草动物协助传粉和种子传播,还有助于提高抗逆性,如抵御低温和紫外线伤害,以及防治植物病害[1-2],同时还是迄今为止发现的最强效的自由基清除剂,具有抗氧化衰老、抗突变、抗癌与抗动脉硬化等功能,对人体有保健功能[3-4]。
花青素是植物次生代谢的重要产物之一,其生物合成涉及多个酶,如苯丙氨酸裂解酶(PAL)、黄烷酮3-羟基化酶(F3H)、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)、花青素合成
酶(ANS)和黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(UFGT),而这些酶各自因物种不同而成为主导花青素形成的关键酶。研究表明,F3H、DFR、ANS和UFGT分别是金鱼草、矮牵牛、石竹和葡萄的关键酶基因[5-6]。目前大多数的研究集中在地上器官和组织中花青素方面,而对地下器官花青素的研究较少。
山药作为药食两用的植物,其营养价值、药用价值及抗病机理正逐步被发现和证实,并愈来愈受到广大消费者的青睐,具有十分广阔的市场前景[7]。紫山药(Dioscorea alata L.)是天然紫色山药品种,富含花青素,在南非和中国南部的栽培面积很广[8]；紫山药皮可作为提取紫色素的来源[9]；作为一种新型的天然色素资源,紫山药在食品、化妆品及医药等行业中也将具有广阔的应用前景。因此对山药花青素的研究不仅具有重要的理论意义,还具有较好的实用价值。
我们在前人研究的基础上,以紫肉山药和白肉山药为试验材料,分析了花青素合成基因在两者之间的表达差异,以期找出紫山药花青素合成的关键基因,为进一步研究紫山药花青素合成途径中各个基因的调控机理提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 试材及取样
供试材料为紫山药品种“Yzi006”(紫肉)和白山药品种“Ybai002”(白肉)。于2013年4月2日将它们种植于江苏省农业科学院(南京)实验基地,于4月26日出苗。在出苗后第50天分别取幼叶、成熟叶、幼茎和成熟茎；于出苗后第50、65、80天(块茎膨大初期)，第95、110、125天(块茎膨大盛期)，第140、155、170天(块茎膨大后期)，以及第185天(块茎膨大末期)分别取地下块茎,所取样品用液氮速冻后,保存于-70 ℃备用；每份样品均取样3次，作为重复。山药生育期的划分参考黄文华[10]和殷剑美等[11]的方法。
1.2 克隆及测序
RNA提取和cDNA第一条链的合成参照Valderrama-Cháirez等[12]的方法(本文略加改进)。
根据NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中Actin-2、PAL、F3H、DFR、ANS、UFGT基因序列在山药基因组EST数据库中的比对结果,用Primer 5软件设计PCR引物(表1),进行扩增。PCR反应条件为:94 ℃预变性10 min；94 ℃ 40 s,56 ℃ 40 s,72 ℃ 90 s,32个循环；72 ℃延伸10 min。引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。PCR扩增产物用凝胶回收试剂盒回收,与pMD18-T载体在16 ℃下连接过夜,通过DH5α转化克隆,挑选阳性克隆菌液送交南京金斯瑞生物科技有限公司测序。 1.3 实时荧光定量PCR
在NCBI中,使用Blastn软件进行序列比对,在确定目的片段为山药中相关基因的核苷酸序列片段后,用Beacon Designer 7软件分别设计了各基因的荧光定量PCR引物(表1)。对不同组织中各个基因的实时定量检测分析在ABI7500 Real Time PCR仪(由美国应用生物系统公司生产)上完成。 1.4 花青素含量的测定
花青素含量的测定参考Merthens[13]的方法。将0.1 g新鲜组织材料切碎，加入6 mL提取液(浓盐酸∶80%乙醇=1∶99, v/v)浸提10 h。花青素含量的计算公式为: Q=(A530-0.25×A657)/FW,式中Q为花青素相对含量；FW为样品鲜重(g)。
花青素相对积累量的计算公式为: An=Qn×FMn,式中： An为花青素相对积累量； n为样品取样时间； Qn为花青素含量； FMn 为1株的块茎鲜重(g)。花
山药花青素合成关键酶基因的解析
