小麦γ -TMT基因的克隆与表达分析
刘媛媛，郭启平，党仁美，张 珊，闻珊珊*
【摘 要】摘 要:γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E合成途径的关键酶之一。该研究采用RT-PCR方法，从小麦品种‘中国春’中克隆得到小麦γ -TMT基因的3个同源拷贝，其CDs(coding sequence)序列相似性为99.12%； 其中Ta-γ -TMT-6A和Ta-γ-TMT-6B编码区长度为1 101 bp，编码366个氨基酸，而Ta-γ-TMT-6D因发生无义突变，编码365个氨基酸。生物信息学分析表明，3个蛋白分子量分别为39.58、39.53和39.50 kDa，理论等电点分别为6.67、6.41和7.08，都属于亲水性不稳定非分泌型蛋白。系统进化分析表明，小麦Ta-γ-TMT蛋白与糜子Pm-γ-TMT的亲缘关系相对较近。实时定量PCR分析表明，小麦Ta-γ-TMT基因在根、茎、叶、颖壳、种子中均有表达，在叶片中表达量最高；ABA、NaCl、PEG均能诱导Ta-γ-TMT基因的上调表达。该研究结果为进一步探讨小麦γ -TMT基因的功能奠定了基础。 【期刊名称】西北植物学报 【年(卷),期】2019(039)005 【总页数】10
【关键词】关键词:小麦；γ-生育酚甲基转移酶；基因克隆；表达分析 基金项目:西北农林科技大学学科建设项目“作物转基因平台建设”
维生素E最早发现于1922年，Evans和Bishop在研究小鼠时发现的一种脂溶性小分子有机化合物，小鼠缺乏这种小分子物质会导致不育，因此后来把这种物质称为生育酚[1]。根据侧链基团是否饱和，可将维生素E分为生育酚(tocopherols)和三烯生育酚(tocotrienols)两大类，每类又依芳香环上甲基位
置和数目的不同各分为α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ-三烯生育酚，α-型有3个甲基，β-和γ-型有2个甲基，而δ-型仅有1个甲基[2]。在这8种成分中，α-生育酚的生理活性最高(α、β、γ、δ-生育酚的相对活性分别为100%、50%、10%和3%，α-三烯生育酚约为30%，而其他三烯生育酚为10%左右)，并被人体优先吸收和利用，这是由肝脏中的α-生育酚转移蛋白(α-tocopherol transfer protein)优先结合α-生育酚的特性决定的[3]。维生素E是人体营养的必需成分，每天摄入适量的维生素E可以预防糖尿病、肾病的发生，维生素E在治疗老年痴呆、降低心血管疾病及白内障发生、预防治疗癌症等方面也具有重要作用[4-5]。另外，维生素E可以用作脂肪和含油食品的抗氧化剂，还可作为饲料添加剂，提高动物免疫力，改善肉质[6]。对于植物自身来说，维生素 E 可清除植物体内的自由基，保护膜的完整性，不仅能够提高植物对高温、干旱、盐碱、重金属等非生物胁迫的抵抗力，在细胞信号转导以及碳水化合物的代谢等方面也发挥着重要的作用[7]。
维生素E在生物合成时首先在不同酶的催化下生成γ、δ 2种类型，然后在γ-生育酚甲基转移酶(γ-tocopherol methyltransferase，γ-TMT)的催化下分别生成α、β型[8]。由此可见，γ-TMT是决定植物中生育酚成分和活性的关键酶，控制着组织中的α-生育酚水平的高低。而α-生育酚的高生物活性和常温下的较强抗氧化性[9]，使得提高α-生育酚含量成为重要的育种目标之一。目前，γ -TMT基因在拟南芥[10]、大豆[11]、玉米[12]、花生[13]等多种植物中都已被克隆和研究。在功能验证方面，Shintani 等[10]的研究表明，在拟南芥中过量表达γ -TMT基因可使α-生育酚的含量由原来占总生育酚含量的1%上升到85%～95%，与野生型植株相比，种子中的α-生育酚水平增加80倍以上。小
麦作为人类饮食的重要组成部分，维生素含量是评价其营养价值的重要指标；提高小麦植株中γ -TMT基因的表达量，从而将小麦中含量较多的γ生育酚转变为生物学活性更高的α生育酚，来提高小麦自身的抗氧化能力和小麦的营养价值，具有十分重要的意义。迄今关于小麦γ -TMT基因的研究尚未见报道。本研究对小麦中的3个γ -TMT同源基因进行了生物信息学分析和表达量测定，以期为进一步研究小麦γ -TMT基因的功能奠定理论基础，为提高小麦中高生物活性的α-生育酚含量提供参考依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料与处理
供试材料为普通小麦品种‘中国春’。取籽粒饱满的小麦种子，置于有滤纸铺垫的培养皿中，加Hoagland营养液浸透滤纸但不能浸没种子，放于人工气候箱，黑暗条件下催芽2 d。取发芽长势一致的种子种于黑色小方盆中，土壤配比为基质∶蛭石=3∶1，置于人工气候箱(温度25/22 ℃，光/暗周期16/8 h，相对湿度为60%)，培养长至两叶一心期。对幼苗进行如下处理，处理方案参照刘燕等[14]：将长势一致的幼苗植株洗去根部土壤，置于分别含有ABA(100 μmol/L)、PEG6000(20%)、NaCl(200 mmol/L)的水溶液进行不同胁迫处理，在0、3、6、9、12、24 h时剪取叶片置于-80 ℃冻藏。其中，将处理0 h的叶片作为对照组，实验组与对照组均设置3个生物学重复。上述长至两叶一心期的幼苗，转移至4 ℃春化柜中，春化25 d左右，移苗至温室中继续生长，于小麦灌浆期(花后第10天)取植株的根、茎、叶、颖壳和籽粒于-80 ℃冻藏，用于后续基因的组织特异性表达分析。 1.2 方 法
小麦γ-TMT基因的克隆与表达分析
