3500基因测序仪操作流程
一、启动仪器
1．按下仪器的电源键，当仪器指示灯为绿色时表明仪器正常开启。
2．打开与仪器连接的计算机，点击Ctrl+Alt+Delete界面，点击Administrator，输入密码：Administrator。等待Daemon（隐藏图标），Server Monitor程序完全启动，Server Monitor图标上出现绿色对号时表示连接成功。
3．打开3500 Data Collection 软件，出现 3500 Log In 登录界面，输入用户名和密码，本机用户名为：Administrator，密码为：Administrator1，点击“OK”，打开软件。检查所有耗材的剩余用量、仪器的信息、耗材的使用信息以及仪器维护提示灯信息。
4. 确认检测阴性、阳极缓冲液在刻度线以上，以及确认所有耗材已恢复至室温。
注：3500测序所用到的阳极缓冲液、阴极缓冲液在仪器上可存放一周，POP胶在仪器上存放一周后需置于2-8℃保存，洗液为一次性消耗品，不可重复使用。 5. 将阴性缓冲液、阳极缓冲液、洗液等耗材安装至仪器上后，点击refresh，确认所有耗材均为有效状态。
二、仪器维护
1. 于软件主界面点击Dashbord，于菜单栏中选择Maintenance Wizards选项。 2. 将装有阳极缓冲液的耗材从仪器中取下，安装没有阳极缓冲液的容器，选择WASH pumper chamber and chanels选项，按照仪器指示，开始清洗管路并重新给毛细管灌胶直至完成全部操作。
3. 从Maintenance进入Spatial界面，按图示指示进行空间定位。结果应满足如
下要求：①峰高大致相同（大于6000）；②峰型尖锐，左右堆成；③橙色十字在峰顶端；④峰间距为13-16。当结果满足要求时，选择“Accept Results”，否则，选择“Reject Results”，重新进行空间定位。
4. 从Maintenance进入Spectral界面，按图示指示进行光谱校准。本仪器为8道毛细管，光谱校准品加样的位置为A1-H1，校准结果允许借用周边1道毛细管的结果；光谱校准通过显示绿色，借用信息为黄色箭头，失败为红色。校准成功选择“Accept”，否则，选择“Reject”，重新进行光谱校准。
三、检测运行
1. 测序PCR（以BigDye Terminator v3.1试剂盒为例），标准质粒和样品推荐测序反应体系及反应条件如下：
标准质粒测序反应体系：引物4 μL，Big dye 1 μL，BigDye Seq Buffer 3.5μL，超纯水10.5 μL，模板1 μL。
样品测序反应体系：引物（10 μM）0.5 μL，Big dye 1 μL，BigDye Seq Buffer 3.5μL，超纯水14 μL，模板1 μL。
测序反应条件为：96 ℃ 1 min →(96 ℃ 10 sec → 50 ℃ 5 sec → 60 ℃ 4 min)×25个循环→ 4 ℃保温
2. 测序产物纯化（以CENTRI-SEP spin-columns纯化柱为例介绍）
① 于纯化柱中加入800 μL的无RNase超纯水，颠倒混匀，室温静置30 min。 ② 上下颠倒除尽气泡，去掉纯化柱底部的盖子，置于2 mL洗脱管中，在将纯化柱上部的盖子打开后，盖上盖子，压入空气，柱中的液体自动流入洗脱管中直至自行终止，最后洗脱管中的液体大约为200-250 μL，弃掉滤液。
③ 750×g离心2 min去除多余液体，离心完毕后洗脱管中约有300 μL液体。
④ 将纯化柱转移至1.5 mL的样品收集管中，从柱的斜面上缓缓加入20 μL的PCR测序产物。
⑤ 750×g离心2 min，取滤液备用，静止重复离心。 3. 测序产物加样
① 于待检测孔中加入10 μL的Hi-Di甲酰胺后，再次加入10 μL纯化后测序产物，混匀，尽量避免气泡产生，不加样的空中加入10 μL的超纯水。 ② 于96孔板上安装胶垫，按照顺序组装到自动进样器上。
4. 数据收集软件运行
①点击Start pre-heat预热30 min，POP7和POP4的胶预热到60 ℃，POP6的胶预热到50 ℃，预热后检查detection cell的温度。
②通过Main workflow键进入Set up视窗，选择Define Plate Properties界面建立新的样品反应板，在Name栏输入样品板的名称，板子类型：96孔板，毛细管长度：50 cm，胶以及测序类型根据需要选定。
③输入样本名称，选择相应的 Assays，File Name Conventions，Results Groups。 ④切换到Load Plates for Run视图，从Recent Plates找到要电泳的反应板，点 击Link Plate（灰色表示反应板连接上，黑色则表示没有连接上），点击Start Run 进行电泳。
⑤切换到 Monitor Run 视图，通过 Assay，Sample，EPT界面查看样品的电泳 情况；通过 Flags Found 界面借助软件可直接判断样品的结果是否满足质量要求，红色旗帜表示不满足质量要求，绿色旗帜表示满足质量要求。
⑥ 进入Review Results视窗，点击View Fragment/HID Results 查看样品的电泳 结果。如 Offscale（峰过高，导致渗透峰产生），Board Peak（宽峰）等要素的图
3500基因测序仪操作流程
