该技术操作简便快速,可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（Etｈｉdiｕm ｂromide， EB） 染色,在紫外光下至少可以检出1－10ng 的DNA条带，从而可以确定ＤNＡ片段在凝胶中的位置。
三、材料、设备及试剂
1. 材料：含pET3２ａ的E． coli DH５α菌株,1.5ml 塑料离心管(又称ｅpｐendorｆ 管),离心管架。 2. 设备：台式高速离心机，恒温振荡摇床,高压蒸汽消毒器(灭菌锅),涡旋振荡器，移液枪(20μl,200μｌ,１0００μｌ）及枪头,琼脂糖平板电泳装置，微波炉或电炉,紫外透射仪。 3. 试剂
（1）ＬB 液体培养基： 酵母膏 ５ｇ ，蛋白胨 10g ,ＮａＣl 10g,加蒸馏水至 1000ml ，用NaOH和HCl调节ｐH ７.0~7.2,分装灭菌。
（2）LB 固体培养基：加１.5％琼脂粉的LB液体培养基,灭菌倒平板。
（3）氨苄青霉素(Aｍｐicｉlｌiｎ， Ａmp)母液:配成50mg／ml 水溶液, -20℃保存备用。 （4）溶菌酶溶液:用10ｍmol/L TriｓＨＣl(pH8.0）溶液配制成10ｍｇ/ｍｌ,并分装成小份(如1.５ml)保存于－20℃。
（5）3moｌ/ｌ ＮaAc (ｐH5.2):50mｌ 水中溶解40.81g NaＡc?3H2O,用冰醋酸调pH 至５．２, 加水定容至100mｌ， 分装后高压灭菌，储存于４℃冰箱。
（6）溶液Ⅰ：５0 mmol/L 葡萄糖，25 mｍoｌ/Ｌ Trｉs．Cl (pＨ8.0）, 10mｍol／L ＥＤTA (pH８．0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100mｌ,高压灭菌１5 分钟，储存于４℃冰箱。 （7）溶液Ⅱ:０.2 moｌ/L ＮaOH (临用前用1０mol/Ｌ NaOH 母液稀释)，１% SDS。 （8）溶液Ⅲ：5 mｏl／L KAc 60mｌ，冰醋酸１1．５mｌ, H2Ｏ ２8．5ｍl,定容至1００mｌ, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ ３mol／L, Acˉ 5mol/L。
（9）RＮA 酶A 母液:将RNA 酶A 溶于10mmｏl/Ｌ TrisHCl(pH7.5), １5ｍmol/L NaＣl 中,配成10mg/ml的溶液,于10０℃加热15 分钟,使混有的ＤNA 酶失活。冷却后用1.5ｍｌ epｐeｎdｏｒｆ 管分装成小份保存于-２0℃。 （10）酚:氯仿:异戊醇＝2５：２4:１(V/V/Ｖ)。
（11）ＴE 缓冲液：10 mｍo/L TｒisＨＣl （ｐH8.0）,1 mｍoｌ／Ｌ EDTA (pＨ8.０)。高压灭菌后储存于4℃ 冰箱中。
（12）电泳所用试剂:
①.TBE 缓冲液(5×):称取Tris ５4g，硼酸27.5g，并加入０．5Ｍ EＤTA(pH８.0) 20mｌ，定溶至1000ｍl。
②.上样缓冲液(6×):0.２5% 溴酚蓝，4０% （ｗ/v) 蔗糖水溶液。
③.溴化乙锭(:将EB 配制成1０mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。 四、操作步骤 1. 细菌的培养和收集
将含有质粒ｐEＴ3２ａ 的DH5α菌种接种在ＬB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中， ３７℃培养12－24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ｍｌ LB 液体培养基(含５0μｇ/ｍl Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。 2. 质粒ＤNA快速提取
（1）取１.5ml 培养液倒入1．5mｌ eｐpendorf 管中,4℃下１2000g 离心３0 秒。 （2）弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。
（3）菌体沉淀重悬浮于1００μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10 分钟。
（4）加入新配制的溶液Ⅱ2００μl， 盖紧管口，快速温和颠倒eppｅndｏrf 管数次,以混匀内容物(千万不要振荡）,冰浴5 分钟。
（5）加入１５0μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10 秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟，4℃下12000g 离心5－10 分钟。
（6）上清液移入干净ｅppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿(１：1),振荡混匀,４℃下12０0０ｇ 离心5分钟。
（7）将水相移入干净ｅpｐendｏｒf 管中，加入２ 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于－20℃冰箱中２0分钟，然后4℃下１200０g 离心１0 分钟。
（8）弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ｍl 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下1２000ｇ 离心5-10 分钟。
（9）吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥１０ 分钟或室温干燥。 （10）将沉淀溶于20μl TE 缓冲液(pＨ8．0，含２0μg ／ｍl RNaｓeA)中,储于-２0℃冰箱中。 3. 质粒DNA的检测
1、取5×TBE 缓冲液２0ｍl 加水至２00ｍl,配制成0.５×TBE 稀释缓冲液,待用。 2、胶液的制备：称取0.4g 琼脂糖,置于2０0ｍｌ 锥形瓶中,加入５0ml 0.5×ＴＢE 稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。 ３、胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1ｃｍ)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm 左右的间隙。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀，速度也不可太快,否则容易出现气 泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBＥ 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4、加样:取1０μl DNA与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换tip 头,以防止互相污染，注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-８0Ｖ，电流在4０mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约２ｃm 时,停止电泳。
6、染色:未加ＥＢ 的胶板在电泳完毕后移入0．5μg／ｍl 的ＥB 溶液中,室温下染色2０-25 分钟。 7、观察：在波长为2５4nｍ 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB 的电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。
五、实验结果及分析 六、思考题
琼脂糖凝胶电泳过程中影响DNA迁移率的因素有哪些？
实验十 ＰCＲ扩增目的基因
一、实验目的
通过本实验学习PCＲ反应的基本原理与实验技术。
二、实验原理
多聚酶链式反应(polｙmerase ｃhain reaction, PＣR)基本原理类似于ＤNＡ的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PＣR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。
1. 模板DNA的变性：模板DNA经加热至９3℃左右一定时间后,使模板ＤＮA双链或经PCR扩增形成的双链DNＡ解离,使之成为单链,以便它与引物结合，为下轮反应作准备;
2. 模板ＤNA与引物的退火（复性）：模板DNＡ经加热变性成单链后，温度降至55℃左右,引物与模板DＮA单链的互补序列配对结合；
3. 引物的延伸：DNＡ模板－引物结合物在Taq DNＡ聚合酶的作用下,以ｄＮTＰ为反应原料，靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板ＤNA 链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2~3小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。
典型的PＣR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、ｄNTP、ＭｇCl2、两个合成的DNＡ引物、耐热 Taq聚合酶。 三、仪器与试剂
1. 仪器与耗材：PCＲ热循环仪,琼脂糖凝胶电泳系统，移液枪、离心管。 2. 试剂
（1)10×PCR Ｂuffｅr
（2） ｄNTＰ （ 其中包括dＡＴP、dCTＰ、ｄGTP与ｄTTP；每种浓度均为2．５ mｍol/L ) （3） M13 Forｗard 和Reverse引物(10 μM) （4） ＤNＡ模板 (质粒ＤＮA,100 ng/μL ） （5） Taq DＮA聚合酶(５ U/μL）
四、实验步骤
1. 反应体系：
在ＲCR管中加入以下反应体系。 反应物? １0×PＣR缓冲液 2.5ｍmol/L dＮTP
体积/μL 2.5 1．0
上游引物 下游引物
Ｔaｑ DNA聚合酶 模板ＤNA（１nｇ/μL) 加ｄdH２O至2５μL
2.反应条件：
1.０ 1.0 0．２ 1.０ 18.３
在PCR热循环仪上设置以下程序，按程序设置的条件进行扩增。 （１)9４℃预变性5ｍin； (２）94℃变性4５s; (3）5５℃退火45ｓ； (4)72℃延伸60s；
(５）重复步骤(2)～（４)3０次; （６)72℃延伸10ｍin； （7）４℃ ∞。
3. 琼脂糖凝胶电泳分析PＣR结果
配制1%琼脂糖凝胶，取10 μL扩增产物电泳。保持电压120Ｖ。电泳结束后,在紫外灯下观察结果。
五、实验结果及分析 六、思考题
影响PＣR反应效率的因素有哪些？
生化与分子生物学实验指导
