六、思考题
影响酶促反应速度的因素有哪些？它们如何影响酶的活性?
实验七 酶的活性及专一性测定
一、实验目的
通过本实验,了解酶的活性测定方法及其对底物催化的专一性。 二、实验原理
唾液淀粉酶能专一的催化淀粉水解,生成一系列水解产物，即糊精、麦芽糖、葡萄糖等。麦芽糖或葡萄糖都属于还原糖，能使班氏试剂中的二价铜离子还原成亚铜，并生成砖红色的氧化亚铜。淀粉酶不能催化蔗糖水解，且蔗糖本身不是还原糖,所以不能与班氏试剂作用呈色，以此证明酶催化底物的专一性。 三、器材及试剂
1. 器材:试管、试管夹、样品杯、滴瓶、温度计、恒温水浴箱,冰箱等。 2. 试剂:
(1)0．５%淀粉溶液（含0.3%NaCl)：称取可溶性淀粉0．5ｇ,加５mｌ蒸馏水调成糊状，徐徐倒入８0mｌ煮沸的蒸馏水中，不断搅拌,待其溶解后，加0.3gＮaCl，加蒸馏水至１00ml。此液应新鲜配制，防止细菌污染。
（2）２%蔗糖溶液:称2g蔗糖，加蒸馏水至100ml溶解。
(3）班氏试剂:溶解结晶硫酸铜17.3g于100ml热的蒸馏水中,冷却后加水至１50ml为A液。取柠檬酸钠1７3g和无水碳酸钠100g,加蒸馏水600ml ,加热溶解,冷却后加水至８50ml为B液。将A液缓慢倒入B液中,混合即可。
（4)稀释唾液:用清水漱口,清除食物残渣。再含蒸馏水15ml作咀嚼运动,2分钟后将稀释唾液收集于样品杯中备用。 （５)碘-碘化钾溶液： 四、实验方法
１. 唾液淀粉酶的活性测定
唾液的稀释:取1０支试管，分别编上号１－6，取１mｌ唾液加入1号试管,加水稀释10倍后从中取出１mｌ加入2号试管，依次梯度稀释。 试剂管号 1 2 1 9 3 １ 9 4 1 ９ ５ 1 9 6 １ 9 唾液（ml） 1 蒸馏水(ml) 9 各取上述稀释的唾液各１ml,分别加入相应编号的试管里，然后向6支试管内同时加入１ml的0.５％的淀粉溶液，振荡混匀后放入37 ℃ 恒温水浴中,10分钟后取出,滴加2滴碘液,振荡混匀，观察颜色,选取颜色变化适中的一支,记录稀释倍数,计算酶的活性,用于后续实验。 2. 淀粉酶的专一性
取3个试管，分别编号，按下表操作,记录实验现象。
试管编号 稀释的唾液淀粉酶/mL ０．5%淀粉溶液/mL 2％蔗糖溶液/mL 蒸馏水/mＬ ３ 3 3 1＃ １ ２# １ 3＃ 1 摇匀，37℃保温15mｉn Ｂeｎedicｔ试剂/mL 2 摇匀,沸水煮２分钟 观察记录结果
五、实验结果及分析 六 思考题
每组中蒸馏水分别起什么作用？将酶煮沸10min，重复以上实验可能会有什么结果?
２ ２
实验八 维生素Ｃ的定量测定
一、目的要求
１． 学习并掌握定量测定维生素C的原理和方法。 2. 了解蔬菜、水果中维生素C含量情况。 二、实验原理
维生素Ｃ是具有L系糖型的不饱和多羟基物,属于水溶性维生素。它分布很广,植物的绿色部分及许多水果（如橘子、苹果、草莓、山楂等）、蔬菜（黄瓜、洋白菜、西红柿等)中的含量更为丰富。 维生素C具有很强的还原性。还原型抗坏血酸能还原染料2,6－二氯酚靛酚(ＤCPＩＰ),本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中,2，6-二氯酚靛酚呈红色,还原后变为无色。因此,当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时,维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以,当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化,此时即为滴定终点。如无其它杂质干扰,样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。 三．材料、器材及试剂 1．材料：新鲜青菜
2．器材:电子天平,酸式滴定管,移液管,容量瓶，量筒,锥形瓶，研钵。 3. 试剂
（1)2%草酸溶液:草酸１g溶于1００ｍl蒸馏水中。
(2) ２, 6-二氯酚靛酚溶液: ２50mg 2，６-二氯酚靛酚溶于1５0ｍl含有5２mg NaHＣＯ３的热水中，冷却后加水稀释至2５0ml，贮于棕色瓶中冷藏（4℃）约可保存一 周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。
(3）标准抗坏血酸溶液（0.2ｍｇ/mｌ): 准确称取20mg纯抗坏血酸(应为洁白色，如变为黄色则不能用）溶于2％草酸溶液中，并稀释至100mｌ，贮于棕色瓶中,冷藏,最好临用前配制。
四．操作步骤
1．样品的处理和提取
（1）取材:称取４.0g样品洗净、切碎。
（2)研磨：样品置研钵中,加少量2%草酸溶液研磨成汁液,用2％草酸溶液冲洗转移至5０ｍl离心管，３０00r/mｉn离心1５min,上清转移到５０mｌ容量瓶中,2%草酸溶液定容至５0ml。 ２. 空白测定
取2%草酸10ｍl，放入5０ml三角瓶中，用2,６-二氯酚靛酚钠溶液滴定至三角瓶内溶液呈粉红色，15秒内不褪色为终点，记录所用滴定液体积,重复三次取平均值。 3.标定2,6-二氯酚靛酚钠溶液
取２mｌ标准抗坏血酸溶液加8ml 2%草酸溶液,置于５0mｌ三角瓶内,用2,6-二氯酚靛酚钠溶液滴定至终点，记录所消耗2,６-二氯酚靛酚钠溶液的量,重复三次取平均值。 4.样品的测定
取样品液１0ml，放入５0ｍl三角瓶中,立即用2，６－二氯酚靛酚钠溶液滴定至出现明显的粉红色并保持15秒内不褪色，记录所消耗滴定液的体积，重复三次取平均值。
五．实验结果及分析
Ｘ=（V1-V２)*K＊V*１０0/（W*V3） K＝０．2*2/(V０－V2）
其中Ｘ—1０0克样品所含维生素Ｃ毫克数（mｇ/１0０g) Ｗ—称取样品重(g）
V0—标定染料时滴定标准维生素C所消耗的染料毫升数
V1—滴定样品所用染料毫升数 V２—滴定空白所用样品液毫升数 V3—样品测定时所用样品液毫升数 Ｖ—样品提取液稀释之总体积
Ｋ—1毫升染料液所能氧化维生素C之毫克数
六、思考题
本实验方法的优缺点有哪些?
实验九 质粒DNA的提取与检测
一、实验目的
１、学习质粒 ＤNA 的提取原理与琼脂糖凝胶电泳原理； 2、掌握质粒 DＮA 的提取方法; ３、掌握电泳检测DNA的方法。
二、实验原理
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从１-２０0kｂ 不等,为双链、闭环的DNA 分子,以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中,除了超螺旋ＤNA 外,还会产生其它形式的质粒ＤNＡ。如果质粒DNＡ 两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子，称开环DNＡ（Oｐeｎ cｉrｃulａｒ DNA， 简称oｃDNＡ);如果质粒DNA 的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA（Lｉnear ＤＮA）。当提取的质粒DNA 电泳时,同一质粒DNＡ 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNＡ 片段的标准方法。琼脂糖主要在ＤNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性ｐH 值下带负电荷的DＮＡ 向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定: ＤNA 的分子大小，琼脂糖浓度,DNA 分子的构象,电源电压，嵌入染料的存在及离子强度等。
生化与分子生物学实验指导
