含量：酪蛋白ｇ/100 mＬ牛乳(ｇ%)
五、实验结果及分析
式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。
六、思考题
１、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么?
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
一、实验目的
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法 2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。
二、实验原理
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色,最大光吸收峰在46５nm，当它与蛋白质结合形成复合物时,其最大吸收峰改变为５９5ｎｍ。考马斯亮蓝G－2５0—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内,5９５nｍ下光密度与蛋白质含量呈线性关系,故可以用于蛋白质含量的测定。 考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
离心机的使用说明: １．要离心的离心管和管套要称重,重量不等时将水加在管套里。 2．离心管的放置是对角线放置,要求必须对称。 3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间,定好时间后缓慢旋转转速旋钮,使离心机均匀的提速到预定转速。
分光光度计的使用说明: １.接通电源开关，预热20miｎ后，再选择须用的单色光波长。 ２.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿(溶液装入４／５高度，置第一格)置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值Ａ=0.０0。 ３.推动试样架拉手,使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。 4．测量完毕,取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。 5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。 三、试剂与器材： 1. 试剂:
（1)0.9％ＮaCl 9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。
（2）标准蛋白质：称取５０mg结晶牛血清蛋白定溶于５０ml容量瓶里。
（3）染液：考马斯亮蓝Ｇ－2５0 0.5g,溶于250mＬ95％乙醇,再加入50０mL８5％(W／V)磷酸,保存于棕色瓶中,称为母液。取1５0 ｍL然后加蒸馏水定容到1000mL，保存于棕色瓶中，备用。 2. 器材:
试管;吸管10ｍＬ、l5mL、lmL、0.1mL;７22分光光度计
四、操作方法
1. 标准曲线的制备
取6支试管,按下表加入各试剂:
管号? 0 1 标准蛋白0 0．2 溶液(mｌ） ０．9%NａCｌ溶液１．0 ０．8 (ml) 待测样品/ ／ (ml) 考马斯亮蓝试剂(ｍ5．0 ５．0 l) A595ｎm ２ 0.4 0.6 / 5.0 3 0.６ ０.4 / ５.0 4 ０.8 0.２ ／ 5．０ 5 １.０ ０ / 5．0 摇匀，放置5min,测吸光度值 以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、Ａ5９5为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 待测样品测定
试管中加蛋白质样品1.０mL ,再加入5.0mL考马斯亮蓝G-２50试剂，摇匀，放置5mｉn后，在５95nm波长下吸光度值，记录A５95。根据所测A5９５从标准曲线上查得蛋白质含量。并计算蛋白样品的浓度（mg/ml)。
五、实验结果及分析 六、思考题
蛋白质含量的测定还有哪些方法?其优缺点是什么?
影响酶促反应速度的因素
一、实验目的
通过本实验了解温度、PH、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。 二、实验原理
唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各种糊精和麦芽糖。淀粉溶液与碘反应呈蓝色;糊精根据分子大小,与碘反应分别呈蓝、紫、红、无色等不同的颜色；麦芽糖不与碘呈色。唾液淀粉酶的活性受温
度、酸碱度、抑制剂与激活剂等的影响。
温度：温度降低，酶促反应减弱或停止;温度升高，反应速度加快。当上升至某一温度时，酶促反应速度达最大值,此温度称为酶的最适温度。由于酶的化学本质是蛋白质，温度过高会导致蛋白质构象的改变，因此如果温度继续升高，反应速度反而会迅速下降甚至完全丧失。
酸碱度:唾液淀粉酶最适pＨ为pH６．9,高于或低于酶的最适pH值,都将引起酶活性的降低,过酸或过碱的反应条件可使酶活性丧失。
抑制剂与激活剂：酶的活性常受某些物质的影响,能增加酶的活性称为酶的激活剂：降低酶活性且不使酶蛋白变性的称为酶的抑制剂。如Cl为唾液淀粉酶的激活剂,Cu为唾液淀粉酶的抑制剂。
根据上述性质,可以用碘检查淀粉是否水解及其水解程度,间接判断唾液淀粉酶是否存在及其活性大小。
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三、试剂及器材
1.试剂:
1%淀粉溶液,1％氯化钠溶液，1%硫酸铜溶液,1%硫酸钠溶液,碘液，磷酸氢二钠(0．2ｍmｏl/L）, 柠檬酸溶液(0.１mmol/L)。 ２.器材:
试管,试管夹,恒温水浴锅(37℃),吸管，滴管,试管架。
四、实验操作：
１.收集唾液:实验者先将痰咳尽, 用自来水漱口， 清除口腔内食物残渣, 再含蒸馏水约15 mL， 作咀嚼咕漱运动， 3ｍin后吐入小烧杯中备用。
2.观察温度对酶促反应速度的影响
取试管３支,编号１,2,3，按下表操作: 试剂(ｍl) 1 1 2 ２ 1 2 3 1 2 错误!唾液 错误!1%淀粉 ＼o＼ac(○,１)1００℃（冷却） 37℃ 0℃ 错误!水浴5mｉn 碘液 现象 １滴（冷却) 1滴 １滴
3. 观察pH对酶促反应速度的影响 (1)配制一系列pＨ不等的缓冲液。 试剂（ml) ０.2mmｏl/Ｌ磷酸氢二钠 0.1mmol／Ｌ柠檬酸 ｐH
（2)取试管3支,编号１,２,３,按下表操作： 试剂(mｌ) 1 2 唾液 缓冲液 1%淀粉 碘液 现象 ２ 3（pH5.0０） ２ １滴 2 3（pＨ６.80) 2 ３7℃水浴10ｍiｎ 1滴 1滴 3 2 3(pＨ8．00） 2 1 5.１5 4.85 5.00 2 7.７2 2．28 6.80 3 9.72 0.２8 8.00 4观察激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响 取试管4支，编号１，2,3，4,按下表操作： 试剂 滴 1 2 1%淀粉 唾液 蒸馏水 ２０ 10 6 — — — １滴 20 １0 — 6 — — 1滴 ３ 20 10 — — 6 — １滴 ４ 20 1０ — — — 6 1滴 1％氯化钠 1%硫酸铜 1%硫酸钠 碘液 现象
3７℃水浴5—1０min 五、实验结果及分析
生化与分子生物学实验指导
