准确称取３75mg 甘氨酸,溶解后定容至100ｍl。 （2)５00ml 0．02mｏl/L标准氢氧化钠溶液 (3)20mｌ酚酞指示剂
0.5 ％酚酞的5０ ％乙醇溶液。 (４）400 ml中性甲醛溶液
在50ｍl ３6－３７ ％分析纯甲醛溶液中加入１mｌ ０.5%酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
四、实验方法
1、取３个２5 ml的锥形瓶，编号。向１、2号瓶内各加入0.０5mol/L标准甘氨酸溶液2mｌ和水5ml，混匀。向３号瓶内加入7 ml水。然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂,混匀后各加2 ｍｌ甲醛溶液再混匀，分别用0．0２mｏｌ/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。
重复以上实验两次,记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数。取平均值,计算甘氨酸氨基氮的回收率。
2、取未知浓度的甘氨酸溶液2ml,依上述方法进行测定,平行做几份,取平均值。计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。
五、结果处理
1. 回收率计算：
实际测得量
甘氨酸氨基氮回收率%=
加入理论量
公式中实际测得量为滴定1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数的平均值与第3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度,再乘以14.008。 2. 氨基氮计算:
（V
氨基氮（毫克/毫升)=
未
×100
－V
对
）×ＮNａOH×
14．008
2
公式中V未为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。Ｖ对为滴定对照液(3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。NＮａOH为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度。
六、思考题
为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—NH3+ 基上的 H+，不能用一般的酸碱指示剂？
实验三 蒽酮比色定糖法
一．实验目的:
１．学习分光光度法的基本原理
2．学习对蔬菜和食品中糖含量进行测定的方法
二．实验原理
1．分光光度法基本原理:
溶液中的物质在光的照射激发下,产生对光的吸收效应，不同的物质具有各自选择性的吸收光谱，因此，当某单色光通过溶液时，能量会被吸收而减弱,光能量减弱的程度和物质浓度有一定比例关系，即符合于比色原理——比尔定律。 2.朗伯-比尔定律
Ａ＝ｌｇ(1/T）=Ｋbc
A：为吸光度,
T:为透射比,是透射光强度比上入射光强度 c:为吸光物质的浓度 b：为吸收层厚度
K：比例常数
３．物理意义
当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,起其吸光度A与吸光物质的浓度ｃ及吸收层厚度ｂ成正比。 4.蒽酮比色法
蒽铜比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己糖醛酸反应，反应后溶液呈蓝绿色,在6２0nm处有最大吸收。 蒽酮可与其他一些糖类发生反应,但显现的颜色不同。当样品中存有含较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。对于特定的糖类，反应较稳定。 本法多用于测定糖原含量,亦可用于测定葡萄糖含量。
三.实验试剂
（1)蒽酮试剂:取0.２ｇ蒽酮溶于100ｍL 8０%(V/V）硫酸中,当日配制使用; (２)标准葡萄糖 溶液(0.1mg/ｍL)：(可滴加几滴甲苯作防腐剂); （3）糖样品溶液。
四.实验步骤
1．制作标准曲线:
取干试管6支，依次加入标准糖溶液0，0．2，０.4,0．6，０.8,１．0 ml,并依次用蒸馏水补足体积到1mL,各管均加入蒽酮试剂4mＬ,沸水浴准确煮沸10min，室温放置10mｉn,用1号试管溶液调零，比色测定A620。用标准糖溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标,制作标准曲线。
管号? 1＃ 标准葡萄糖溶０ 液(ml) 蒸馏水１．0 (ml) 样品液／ 2＃ 0.2 0.８ / 3# 0.４ ０.6 / 4# 0.6 0.４ / 5# 0.8 0.2 ／ 6# １．0 ７# 0 0 ／ 1.0 2.样品含糖量测定:无蛋白糖溶液样品溶液
(ml) 置冰水浴中冷却5ｍin 蒽酮试4.０ 剂(mｌ) ４．0 4.0 4.０ 4．0 ４.０ 4.0 沸水浴中准确加热10min,取出,用自来水冷却，室温放置１0min A620nm 糖溶液浓度(mg/ｍｌ) 0 ０．０2 0.04 0．06 ０.08 0.１0 待测 稀释100倍，吸取1mL置试管中，再加入４mL蒽酮试剂,沸水浴中煮沸10分钟，取出后自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量（ｍg/ml）。
五、实验结果
1.制作标准曲线 2.计算样品中糖浓度
六、思考题
H２SＯ4在实验中起什么作用？
酪蛋白的制备
一、实验目的
1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。
二、实验原理
牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为３5g／Ｌ。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电
点为4．7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时,酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。
三、材料、试剂与仪器
１. 材料 新鲜牛奶 2. 试剂
（1）．95％乙醇 1 200ｍL （2）无水乙醚 １ 200ｍＬ （3）0．2mol/L pH4．７醋酸—醋酸钠缓冲液 300ｍl 先配A液与B液
Ａ液:0．2mol／L醋酸钠溶液 称NaＡC·3H2O ５4.44g，定容至2０00ml。 B液：0.2mｏl/L醋酸溶液,称优 纯醋酸(含量大于９9.8％）12.0g定容至1０00mｌ。
取Ａ液1770mｌ,Ｂ液１230mｌ混合即得Ｐh4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。 （4）乙醇—乙醚混合液 乙醇：乙醚=1 ：１(V/Ｖ) 3. 仪器
离心机、抽滤装置、精密pH试纸或酸度计、电炉、烧杯、温度计
四、操作步骤
1. 酪蛋白的粗提
100ｍL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4．７的醋酸缓冲液100mL．用精密ｐH试纸或酸度计调ｐH至４．7。 将上述悬浮液冷却至室温。离心1５分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 2. 酪蛋白的纯化
（1）用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟(3 000r/ｍin)，弃去上清液。
（2）在沉淀中加入30mＬ乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀２次，抽干。 （3）将沉淀摊开在表面 上，风干;得酪蛋白纯品。 3. 准确称重,计算含量和得率。
生化与分子生物学实验指导
