毕业论文开题报告
海洋生物资源与环境
假微型海链藻DGAT基因cDNA全长序列的分子克隆和分析
一、选题的背景与意义 1.微藻制备生物柴油 1.1生物柴油
近年来，随着全球经济的快速增长，石油和煤炭等化石能源的消耗大幅度上升，化石能源短缺危机已迫在眉睫，对生物质能等可再生能源的关注逐渐成为热点。
生物柴油，又称单烷基脂肪酸酯，是以动、植物油脂为原料，与醇类经转酯作用获得的单烷基脂肪酸酯。生物柴油作为化石燃料的替代品，与化石柴油和燃料乙醇等其他液体燃料相比，有着突出的特性：生物柴油不含石蜡，闪点高，燃烧性能和效率要高于普通柴油，使用时更安全；可以通过种植、养殖或培养源源不断地得到，因而属于可再生资源；生物柴油产品中含硫和氮较少，可以减少产生SO2和NO对大气的排放量。以淀粉类作物和木质纤维素类物质发酵产生的燃料乙醇，燃烧后尾气排放污染小，但其热值只有普通汽油的2/3，比柴油更低，且乙醇易吸水使燃烧值下降。
1.2微藻制备生物柴油的优势
作为新一代生物柴油原料，微藻拥有很多优势。例如：
微藻种类繁多，分布极其广泛。全球已经鉴定的微藻大约有40000种，且其数量还在不断增加。大多分布在江海湖泊中，不与农作物争地，可以整年生长。
微藻通常呈单细胞或丝状体，结构简单，整个生物体都能进行光合作用，所以光合作用效率高，生长周期短、速度快。微藻还可利用微生物发酵技术，在光反应器中高密度、高速率培养。在同样条件下，微藻细胞生长加倍时间通常在24 h内，对数生长期内细胞物质加倍时间缩短至3.5 h。
微藻油脂含量高。例如葡萄藻（Botryococcus braunii）的含油量为细胞干重的25～75%。而高等植物种子的脂肪酸含量仅为干重的15%~20%左右。其油脂组成与一般油料植物相似，以C16、C18系脂肪酸为主。
微藻能吸收并利用工农业生产中排放出的大量CO2和氮化物或从废水中取得氮、磷等，有利于改善环境。
1.3 假微型海链藻
假微型海链藻属于中心硅藻纲，圆筛藻目，海链藻属。
通过尼罗红染色法对宁波大学微藻种质库的63株微藻进行筛选，研究结果显示，中性脂含量最高的为假微型海链藻（T. pseudonana），虽然假微型海链藻的中性脂含量最高，但是其细胞密度在整个生长期都比较低，因此对它的分子研究及培养条件的优化极为重要。
1.3.1 DGAT
DGAT (二酰甘油酰基转移酶)催化TAG（三酰甘油）合成途径的最后一步反应，也是该途径的限速酶，对它的研究对于进一步提高微藻含油量，降低生物柴油生产成本，有着十分重要的意义。另外，DGAT基因全长的克隆为下一步转入到拟南芥中提供目的基因。
二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 1. 研究的基本内容
1.1 假微型海链藻（T. pseudonana）DGAT基因全长cDNA的克隆 1.2 DGAT基因全长cDNA序列分析、比对
2. 拟解决的主要问题
2.1 得到假微型海链藻DGAT基因全长cDNA的克隆 2.2 分析和比对DGAT基因全长cDNA序列 三、研究的方法与技术路线：
1.假微型海链藻（T. pseudonana）DGAT基因全长cDNA的克隆 1.1材料
实验材料假微型海链藻（T. pseudonana）取自宁波大学微藻种质库，于5000 mL三角瓶中，在温度20℃，盐度25～30‰，光照强度为50 μmol/(m2·s)，光暗比12 h:12 h的条件下采用NML3#培养液（表1）培养10 d。
表1. NML3#培养液配方 Table.1. Composition of culture fluid 营养成分 KNO3 KH2PO4 EDTA-Na2 C6H5O7Fe.5H2O MnSO4 VB1 VB12 含量（g/L） 100 10 20 1 0.5 6×10-3 5×10-5 Na2SiO3 2 1.2方法
1.2.1总RNA的提取
首先，将三角瓶中的假微型海链藻（T. pseudonana）离心，去上清，得到100 mg的藻泥于2 ml EP管中。然后加入1 mL的Trizol试剂，超声波清洗机中超声5 min后提取总RNA。最后用20 μL DEPC水（RNase Free）溶解RNA，测定RNA的浓度和OD260/OD280的值。
1.2.2反转录合成cDNA的第一条链
取各样品RNA 1 μg按Takara PrimeScriptTM RT-PCR Kit（宝生物工程有限公司）操作方法：在一个DEPC水处理过的PCR管中加入总RNA 1 μg，Oligo dT Primer (2.5 μM) 1 μL，dNTP Mixture（10 mM each）1 μL，加RNase Free dH2O补至10 μL，PCR仪上65℃反应5 min后，离心数秒使模板RNA、引物等的混合液聚集于PCR管底部。然后加入5×PrimeScriptTM Buffer 10 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL）0.5 μL，PrimeScriptTM RTase（for 2 step）0.5 μL，RNase Free dH2O 5 μL，混匀后PCR仪上进行反转录反应：30℃ 10 min，42℃ 30 min，95℃ 5 min，得到的cDNA产物可直接用于基因全长cDNA的克隆或放﹣20℃保存。
1.2.3 3’-RACE引物设计
按照NCBI上公布的假微型海链藻（T. pseudonana）CCMP1335的DGAT基因的全长序列（XM_002287179.1），用Primer Premier 5.0设计DGAT基因的特异性引物，接头及接头引物由3’-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒提供（表6）。
表6. 假微型海链藻（T. pseudonana）3’-RACE引物
Table.6. Primers in 3’-RACE of T. pseudonana
引物名称 Primer name 3’-RACE Adaptor 3’-RACE Outer Primer 3’-RACE Inner Primer Gene Specific Outer
Primer Gene Specific Inner Primer ATCATATCCTCCCTCGAAG 引物序列 Primer sequence （5’—3’） 含有由Takara独特设计的dT区域及Adaptor Primer部分 TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG
TTGGGTCGATCTGATATCC
1.2.4 3’-RACE获得DGAT基因全长cDNA
Outer PCR反应体系为50 μL：反转录反应液 3 μL，1×cDNA Dilution BufferⅡ 7 μL，Gene Specific Outer Primer (10 μM) 2 μL，3’-RACE Outer Primer (10 μM) 2 μL，10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Free) 4 μL，MgCl2（25 mM） 3 μL，Takara LA Taq（5 U/μL） 0.25 μL，dH2O 28.75 μL。反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35个循环；72℃ 10 min。
Inner PCR反应体系为50 μL：稀释后的Outer PCR产物 1 μL，dNTP Mixture (2.5 mM each) 8 μL，10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Free) 5 μL，，MgCl2（25 mM） 5 μL，Takara LA Taq（5 U/μL） 0.5 μL，Gene Specific Inner Primer (10 μM) 2 μL，3’-RACE Inner Primer (10 μM) 2 μL，dH2O 26.5 μL。反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35个循环；72℃ 10 min。
1.2.5 测序分析
取5 μL PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，检测3’-RACE PCR扩增产物。将PCR产物连接到pMD18-T受体上，转化到大肠杆菌中再进行测序。
1.3 技术路线
总RNA的提取 反转录合成cDNA的第一条链 3’-RACE引物设计 3’-RACE获得DGAT基因全长cDNA 测序、分析 四、 研究的总体安排与进度：
2010.7—2010.9：查阅资料、预实验等前期准备。
2010.9—2010.11：假微型海链藻DGAT基因全长cDNA的克隆 2010.11—2010.12：DGAT基因全长cDNA序列分析、比对 2011.1—2011.2：整理数据，撰写论文。 五、 主要参考文献：
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假微型海链藻DGAT基因cDNA全长序列的分子克隆和分析开题报告
