ABO血型正、反定型操作规程
[目的]
保证ABO血型鉴定准确，确保临床输血安全。 [适用范围]
XXX医院输血科 [职责]
具有专业技术的工作人员主要负责本院输血（或备血）标本的ABO血型鉴定（但只对该单份标本负责）。 [相关文件]
试剂采购、保存和使用管理程序 设备采购、使用管理程序 消毒与清洁管理程序
标本采集、运输、保存和报废管理程序
紧急用血管理程序 [相关记录]
仪器设备的采购、使用和维护记录 仪器的温度记录
恒温水温箱的换水和消毒记录 消毒液的配置记录 清洁消毒记录
试剂采购、使用记录 标本交接和报废记录 紧急用血记录 [实验原理]
ABO血型是根据红细胞表面存在的凝集原决定的。存在A凝集原的称为A型，存在B凝集原的称为B型。而血清中还存在凝集素。当A凝集原与抗A凝集素相遇或B凝集原与抗B凝集素相遇时，会发生红细胞凝集反应。一般A型血清中含有抗B凝集素，B型血清中含有抗A凝集素，因此可以用标准血清中的凝集素与被测者的红细胞反应（称为正定型），用标准红细胞与被测者血清中的凝集素反应（称为反定型），以确定其ABO血型。 [仪器器械]
玻璃试管、玻片、记号笔、一次性塑料滴管、显微镜、普通离心机、试管架、恒温水温箱、试剂保存冰箱、标本保存冰箱。 [试剂]
抗A标准血清、抗B标准血清、A型标准红细胞、B型标准红细胞、O型标准红细胞、生理盐水。以上试剂均为有合格证件的正品。 [标本收集与处理]
1．受检者血清：采集受检者静脉血2~3ml，经1000r/min离心1分钟或室温静置1小时后取上清。
2．2~5%的受检者红细胞：采集受检者静脉血或末梢血，用生理盐水制成2~5％红细胞盐水悬液备用，制备方法见本节质量控制和注意事项。
3．标本出现中度以上溶血者，为不合格标本，不能用于检测。 [实验方法与步骤]
1.ABO血型的正定型（试管法）：
⑴、取2支试管，分别标上抗A和抗B；
⑵、制备待测标本2~5%的红细胞悬液（取1支试管，加入2ml生理盐水，再加入1滴待测标本红细胞，混匀备用）；
⑶、在抗A管中加入2滴抗A标准血清，在抗B管中加入2滴抗B标准血清；
⑷、在抗A和抗B管中分别加入1滴已制备好的待测标本2~5%红细胞悬液； ⑸、混匀后，立即对称放入离心机中进行1000r/min离心1分钟，或室温静置1小时，再轻轻摇动试管，使沉于管底的红细胞浮起，先肉眼观察有无凝集现象，如内眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。
⑹根据有无凝集现象判定结果如下。注意凝集强度，此有助于A、B亚型、类B或cisAB的发现。
ABO血抗A标准血抗B标准血清
型 清
A型 ＋ －
B型 － ＋
O型 － －
AB型 ＋ ＋
⑺凝集强度判断标准
4十 红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。 3十 红细胞凝集成数小块，血清尚清晰。 2十 红细胞凝块分散成许多小块，见到游离红细胞。 1十 肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞。
土 镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多
游离红细胞。
MF 混合凝集外观(mixed field)是指镜下可见少数红细胞凝集，而极大多数红细
胞仍呈分散分布。
一 表示阴性，镜下未见凝集，红细胞均匀分布。
2.ABO血型的反定型（试管法）：
⑴、取3支试管，分别标上A、B和O；
⑵、在3支试管中分别加入2滴待测标本的血清；
⑶、将ABO标准红细胞轻轻地充分混匀后，在A管中加入1滴A型标准红细胞，在B管中加入1滴B型标准红细胞，在O管中加入1滴O型标准红细胞；
⑷、混匀后，对称放入离心机中进行1000r/min离心1分钟（或3400 r/min离心15秒）；
⑸、取出后，先观察是否溶血（溶血可能是阳性结果，或者是细菌污染），再轻轻摇动试管，肉眼观察有无凝集现象，肉眼不易分辨的用显微镜观察；
⑹根据有无凝集现象判定结果如下。注意凝集强度，此有助于A、B亚型、类B或cisAB的发现。 ABO血型 A型标准红细胞 B型标准红细胞 O型标准红细胞 A型 － ＋ － B型 ＋ － － O型 ＋ ＋ － AB型 － － － ⑺凝集强度判断标准 （同ABO血型的试管法正定型） [质量控制和注意事项]
1、分型标准血清试剂必须为三证齐全的合格产品，质量性能符合要求，且在有效期内使用。试剂开封后必须贴上注有开封日期和开封人的标签，使用后应及时置于2~8℃专用冰箱中保存，以免细菌污染和变质而影响试验结果。试剂开封后有效期为一周。
2、商用分型标准红细胞试剂必须为三证齐全的合格产品，质量性能符合要求，且在有效期内使用；自制分型标准红细胞试剂必须以3个健康者同型新鲜红细胞混和，用生理盐水洗涤 1~3次，以除却存在于血清中的抗体及可溶性抗原，再制成2~5%的红细胞悬液备用。试剂开封或制备后必须贴上注有开封或制备日期和开封人或制备人的标签，使用后应及时置于2~8℃专用冰箱中保存，以免细菌污染和变质而影响试验结果。试剂开封或制备后有效期为一周。
3、生理盐水启用后，有效期为二周。
4、所有试剂在使用时，必须检查是否有浑浊、变色、凝集等变质现象；凡可疑者，必须更换新的试剂进行检测。若分型标准血清使用时间较长后，最好用已知的ABO标准红细胞检查结果是否与已知的血型相符；若分型标准红细胞使用时间较长后，最好用已知的分型标准血清检查结果是否与已知的血型相符，以防标准血清或红细胞制品污染、变质失效而造成鉴定错误。
5、试管、滴管和玻片必须清洁干燥，防止溶血。
6、操作方法应按规定进行，一般应先加血清，后加红细胞悬液，以便容易核实是否漏加血清。
7、IgM抗-A和抗-B与相应红细胞的反应温度以4℃为最强，但为了防止冷凝集现象的干扰，一般仍在室温(20~24℃)内进行试验，37℃可使反应减弱。
8、离心时间不宜过长或过短，速度不宜过快或过慢，以防假阳性或假阴性结果。用试管法进行ABO血型的正定型时不能测出亚型（如AX），需延长作用时间。
9、在反定型试验中，如果受检者的血清或血浆与O型标准红细胞产生阳性反应，则需要添加自身对照试验。如果自身对照试验为阳性，表明是自身冷凝集素导致。如果自身对照试验为阴性，则表明被检者血清或血浆中可能存在ABO系统以外其它系统的抗体干扰，此时需做其它相关试验加以解决上述定型问题。
10、对含有较多自身冷凝集素的受检者，在使用标准血清进行正定型时往往被误定为AB型，遇到此种情况，需用37℃生理盐水洗涤受检者的红细胞2~3次，以去除吸附在红细胞上的冷凝集素，然后再鉴定血型。
11、观察时应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝固以及缗钱状排列的区别。对于可疑结果，必须更换所用的试剂，重新检测。
12、对于可能存在不完全抗原的时候，应在各反应中加入凝聚胺试剂，以检验不完全抗原的存在。
13、判断结果后应仔细核对、记录，避免笔误。
14、2~5%红细胞悬液的配制：先用生理盐水洗涤红细胞3次，再根据下表进行红细胞悬液的配制。 悬液浓度（%） 压积红细胞（滴） 盐水（滴） 2 1 40(2ml) 5 1 16 (0.8ml) [临床应用] 用于检验人的ABO血型归属。
[血型鉴定的影响因素及解决方法]
准确的血型鉴定是临床安全、有效输血的重要保证之一，但影响血型鉴定结果的因素很多。如发现ABO正反定型结果不一致，应先重复做1次试验。重复做试验时，应严格执行操作规程，使用质量合格的试剂，并细心观察和解释试验结果，就可解决明显的问题。对一些疑难问题必须做如下进一步研究： 1、标本
①血标本的采集错误、稀释和溶血。另从受检者采集l份新鲜血液标本，这样可以纠正因污染或搞错样本造成的不合。标本一般要求离体后尽快实验，最长不能超过3天，每次输血后受血者和供血者的血标本应在2～8℃保存7天。
②患者的药物使用有时也对实验有一定影响，当受血者使用肝素治疗时，应使用硫酸鱼精蛋白对抗使标本凝集；如果受血者使用右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等治疗，应注意将红细胞洗涤。
③受检者红细胞上抗原位点过少(如亚型)或抗原性减弱(见于白血病或恶性肿瘤)，以及类B或cisAB等。●如疑为A抗原或B抗原减弱，则可将受检红细胞与抗—A或抗—B血清做吸收及放散试验，以及用受检者唾液作A、B、H血型物质测定（只对80％HAB分泌型的人有用）。●如受检者为A型血而疑为有类B抗原时，可用下列方法进行鉴别：(1) 观察细胞与抗—A及抗—B的凝集强度，与抗—A的反应要比与抗—B的反应强，这种区别用玻片法作试验更为明显；(2) 用受检者红细胞与自身血清作试验，血清中的抗—B不凝集自身红细胞上的类B抗原；(3) 检查唾液中是否有A、B物质，如果是分泌型，可检出A物质而无B物质；(4) 核对患者的诊断，类B抗原的形成与结肠癌、直肠癌、革兰阴性杆菌感染有关。
④受检者血清中蛋白紊乱(高球蛋白血症)，或实验时温度过高，常引起红胞呈缗钱状排列。如试验结果红细胞呈缗钱状排列，加等渗盐水l滴。混和，往往可使缗钱现象消失。注意不应先加盐水l滴于受检者血清中而后和红细胞做试验，以免使血清中抗体被稀释。
⑤细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。如发现多凝集现象，应考虑由遗传产生的Cad抗原活性；被细菌酶激活的T或TK受体；或产生机制不太明了的Tn受体所引起。多凝集红细胞具有以下特点：(1)能被人和许多家兔的血清凝集；(2)能与大多数成年人的血清凝集，不管有无相应的同种抗体。(3)不被脐带血清凝集。(4)通常不与自身的血清凝集。(5)如有条件可用外源凝集素加以鉴别。
⑥检者血清中缺乏应有的抗-A及或抗—B抗体，如丙种球蛋白缺乏症，老年人血清中抗体水平大幅度下降等。如果试验结果未见凝集，应将细胞及血清试验至少在室温和4℃放置30min，用显微镜检查核实。
⑦血清中有意外抗体，如自身抗—I，常引起干扰。用A1、A2、B、O红细胞及自身红细胞检查受检者血清。如果怀疑是抗—I，用O型(或ABO相合的)脐血红细胞检查。
⑧各种原因引起的红细胞溶解，误判为不凝集。部分溶血时，可溶性血型物质中和了相应的抗体。将红细胞洗涤数次，配成2~5%生理盐水细胞悬液，用抗—A、抗—B、抗—Al，抗—A十B及抗H做试验可以得到其它有用的信息。对受检红细胞作直接抗球蛋白试验，如结果呈阳性，表示红细胞已被抗体致敏。
2、试剂
①运输、贮存等条件不适可导致试剂变质失效，造成配血错误。实验前进行试剂外观、效价等项目质量控制。②不同抗凝剂制备的标准红细胞质量也不同；另外，红细胞悬液过浓或过淡，抗原抗体比例不适当，使反应不明显，易误判为阴性反应。应
依据要求正确配制红细胞浓度。③分型血清效价太低、亲和力不强，如抗—A血清效价不高，可将A亚型误定为O型、AB型误定为B型。实验前应进行试剂效价等项目质量控制。
3、冷凝集素
在ABO血型鉴定和交叉配血的过程中，冷凝集素是影响ABO血型正反不符和交叉配血不合的常见原因，尤其是在冬天气温较低时，某些病人血清中含有冷凝集素而导致出现假阳性。正常人血清中冷凝集素效价一般不高，且在4℃以下时才有活性。但由于人免疫系统的差异，在恶性肿瘤或病原体感染后有时冷反应性自身抗体可异常增高，造成溶血性贫血。这种冷凝集素效价在4℃可高于1000，用37℃生理盐水洗涤红细胞，操作时再置于37℃水浴中轻轻摇动可以排除冷凝集素的干扰。 4、自身免疫性溶血性贫血
红细胞被自身抗体强烈致敏后将干扰ABO定型，且自身抗体的存在会导致交叉配血不合，选择合适的试验方法对红细胞上结合的抗体做放散处理，确定抗体的特异性。如果抗体属于同种抗体，则交叉配血时应选取该抗原阴性的献血者的血液。如果该抗体无法确定特异性，则交叉配血时要根据患者自身红细胞与自身血清的对照反应选取较弱反应的献血者血液，因为自身抗体的干扰而发生ABO正反定型不相符时，可用37℃～45℃生理盐水洗涤红细胞三次，或者用放散后的红细胞（放散方法需不破坏红细胞结构），血清定型则可用洗涤或放散后的红细胞将血清中的自身抗体吸收后再进行。
5、弱凝集
血型试验是抗原抗体反应，当患者红细胞上抗原异常或血清中存在ABO血型以外的不规则抗体时，可能会导致减弱的或缺少的凝集反应。抗原异常包括：①亚型，这种亚型红细胞抗原性较弱，可以通过亚型定型试剂来具体定型。②红细胞抗原形成不足或敏感性降低，如新生儿、老年人及少数恶病质患者。鉴定血型时要注意正反定型的结合，加用抗H和抗A，B型标准血清、A2红细胞等检查唾液中的血型物质，必要时作吸收放散试验以确定。若血清中存在不规则抗体可在反定型用O细胞加以鉴定，有些亚型因为抗原的某些位点缺失，也会产生相对于缺失抗原位点的抗体，这些抗体的产生有助于亚型的判定。 6、细菌性凝集
常见有类B凝集，A型或O型病人因大肠杆菌O86感染，从而使红细胞上获得类B抗原，能与抗B抗体发生凝集，表现为B 或AB型。其不受温度影响，病情好转类B凝集即消失。另外红细胞被细菌或细菌酶污染，红细胞上的T抗原被激活，与供血者中抗T抗体发生凝集。此种凝集在4℃和37℃之间随着温度的升高凝集程度逐渐减弱，在37℃时最弱或消失。 7、混合外观凝集现象
出现混合外观凝集的情况时一般要核对标本，必要时可重新抽取血样。患者在近期有过骨髓移植或输血史、胎盘出血和白血病等应在疾病恢复后再确定血型。其他原因如嵌合现象、A3亚型及Tn多凝集反应等在定型时可帮助正确判断血型。 8、不规则抗体及亚型
血型试验是抗原抗体反应，当患者血清中存在ABO型以外的IgM或IgG和IgM混合型不规则抗体时，必然会导致ABO正反定型不一致。可通过测定唾液中的血型物质来鉴定ABO血型。由于受检者红细胞上有弱抗原，且抗原表达性特别弱，在纸片定型中很可能被错误定型，另外抗A/抗B/抗AB血清的效价低或Ac/Bc/Oc等其他因素的影响，正反定型不相符，也可能被错定或无法确认，应用试管盐水法镜检显示抗-A/抗-B/抗-AB管呈弱的混合外观，正反定型相符，且经吸收放散试验进一
ABO血型正反定型
