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共培养间充质干细胞和造血干细胞中Notch信号的表达
作者：樊志刚 樊红亮
来源：《维吾尔医药》2013年第08期
摘要：目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）体外与脐血来源造血干细胞（HSC）共培养后Notch信号分子的表达。方法：分离MSCs，进而将MSCs与CD34+造血干细胞（HSC）体外共培养，用PCR方法检测MSCs及CD34+细胞表Notch配体和受体的表达。结果：体外实验显示，MSCs及CD34+细胞表面存在Notch信号配体及受体的表达，共培养后Jaaged1、Notch1基因表达明显增加。结论：骨髓间充质干细胞在支持造血中，Notch信号发挥着重要作用。
关键词： 间充质干细胞；造血干细胞；Notch信号
人骨髓中的间充质干细胞（mesenchymal stem cells ，MSCs）是造血微环境的重要组成部分，分泌细胞外基质及多种细胞因子调控造血[1]，。大多数体外培养研究证明，骨髓MSC具有强大的扩增能力，能在体外大量扩增具有自我更新的能力[2]。MSC除分泌细胞因子外，还可通过细胞间的直接接触信号来发挥作用。Notch信号通路进化保守而重要，一些复杂而高级程序如细胞的增殖、分化、存活和凋亡的正常运行正是基于正确的Notch信号转导。造血系统中，造血干细胞高度表达Notch分子，而造血微环境中的骨髓基质细胞含大量的Notch配体【3-4】二者的正常表达及相互作用维持着机体正常的造血功能，当异常表达时可造成恶性增殖性疾病【5-6】。由此推测，MSC可能通过Notch通路调控CD34 +造血干细胞的增殖。该实验中将骨髓来源的MSC与脐血造血干细胞共培养，通过实时PCR分析Notch信号分子在培养前后表达对间充质干细胞的造血支持机制作初步探讨。 1.材料和方法
1.1 材料 脐血来自郑州市妇幼保健医院，骨髓来自郑州大学第一附属医院。DMEM/F12（Hyclone公司）、胎牛血清（FBS Gibco公司） 、淋巴细胞分离液（密度1.077g/cm3 天津TBD公司）、诱导试剂：地塞米松、β-磷酸甘油钠、3-异丁酸-1-甲基黄瞟呤（ IBMX）、胰岛素、消炎痛均为Gibco公司产品，反转录试剂盒， DNA聚合酶，所用引物根据GenBank序列自行设计，引物由北京英俊公司合成。 1.2 方法
1.21 MSC的分离及培养 用无菌的PBS（PH=7.4）将采集的肝素抗凝骨髓1：1等体积稀释，轻轻摇匀后，缓慢叠加在密度为1.077g/cm3的淋巴细胞分离液上，离心，取单核细胞层， 用等体积PBS洗两遍. 在细胞沉淀中加入DMEM/F12培养液，计细胞数，调整细胞密度
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按1.0X107/ml接种于含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，置于培养箱内培养.2d后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每2、3d全量换液一次，细胞达到90% 以上融合时用 0.25% 胰酶消化，冻存后用于实验。
1.22 脐血CD34+细胞的分离 脐血取自健康足月产妇，肝素抗凝后，利用淋巴细胞分离液（1.077g/mL）分离脐血单个核细胞，然后应用MiniMACS CD34+细胞免疫磁珠分选系统分离CD34 +细胞，具体操作见 产品说明书
1.23 共培养和诱导实验 1 x 105/孔MSC接种于24孔坂，待细胞贴壁后加入CD34+细胞1 x 105/孔，加入rhFL 55ng/mL，rhSCF55ng/mL，rhTPO25ng/mL共培养体系。实验分组为 MSC +CD34， 共培养6d后分别收集悬浮细胞与贴壁细胞提取总RNA。同时将共培养后MSC加入脂肪诱导体系和成骨诱导体系【7】，镜下观察。
1.24 PCR检测MSC表面的Notch配体以及CD34+细胞中Hes-1基因的表达 提取细胞总RNA， 以Oligo（dT）i8为引物，用M-MuLV逆转录酶于42℃逆转录为cDNA。以cDNA为模板用于PCR扩增目的基因，β-actin基因做内参照。
1.25 统计学分析 实验数据用均数土标准差表示，实验前后自身对照进行配对T检验，P 2 结果
2.1 骨髓来源MSC的培养
骨髓细胞接种于培养瓶后，细胞呈圆形，透亮，48h换液去除未贴壁细胞后，可见散在的贴壁细胞呈长梭形， 12～16d左右细胞达到80%～90%融合，传代后细胞24h内完全贴壁，形态与原代培养的细胞类似，生长迅速，8天达到完全融合.传至8代后细胞内颗粒增多，细胞逐渐老化。
2.2 BMSC向成骨细胞和脂肪细胞分化的检测
成骨诱导培养后进行ALP染色，倒置显微镜下观察结果显示，培养5天后，细胞变为多边形，4周后形态改变明显，出现大量灰黑色颗粒，（图2A）。脂肪诱导体系中培养7d后，胞体变大，细胞内出现脂滴，诱导至3周特异性油红0染色，将脂滴染成明亮的红色（图2B）。 3 讨论
共培养间充质干细胞和造血干细胞中Notch信号的表达
